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（一）材料与方法
H22细胞瘤腹水（北京大学肿瘤医院）少量，移至50ml离心管中，加适量PBS，将细胞打起，离心洗涤，1500rpm，5min，弃净上清，加少量10%FCS （杭州三利）RPMI1640培养液（HyClone），旋涡振荡，取一块预先用大白鼠鼠尾胶原包被的12孔板(COSTAR)，将12个孔分为三个细胞浓度组，每组四个孔。在A1、A2、A3和A4孔中加20μl上述细胞悬液，A1、A2为实验孔，A3、A4为对照孔；在B1、B2、B3和B4孔中加40μl上述细胞悬液，B1、B2为实验孔，B3、B4为对照孔；在C1、C2、C3和C4孔中加60μl上述细胞悬液，C1、C2为实验孔，C3、C4为对照孔；每孔添加2ml 10%FCS （杭州三利）RPMI1640培养液，第一天照相记录细胞生长状态，补加1ml 10%FCS RPMI1640培养液，并在A1、A2、B1、B2、C1和C2共6个孔中加入4块再生物质，第二天每孔去掉1ml陈旧培养液，加1ml 10%FCS RPMI1640培养液，第三天进行下列项目的检测：
1、观察实验组和对照组细胞的镜下形态，用相差和微分干涉显微镜观察。
2、实验组和对照组细胞用HE染色。
步骤如下：（1）预先配制好染色用全套试剂，并将蛋清/甘油粘片剂涂于洁净载玻片上，吹风机吹干；（2）在培养Ｈ22细胞的12孔培养板中，取第一组的一个实验孔和一个对照孔，去掉实验孔中的再生组织，吹悬细胞，从实验孔和对照孔中各吸出1ml细胞悬液至不同的2ml离心管中；（3）水平转头离心，2000rpm，离心5min，弃净上清；（4）加10ulPBS混悬细胞，制成细胞悬液；（5）将上述制备好的微量细胞悬液，加至载玻片上，用希耳球吹匀平摊；（6）干燥；（7）HE染色：10%甲醛（北京旭东化工厂）固定10min，水洗；苏木精（SIGMA进口分装）染色2min，水洗30s；1%盐酸酒精分化20s，自来水洗20s；稀氨水30s，自来水洗20s；伊红（北京瀛海精细化工厂）染色1min，水洗10s；85%酒精20s；90%酒精30s；95%酒精1min；无水乙醇Ⅰ1min；无水乙醇Ⅱ2min；二甲苯Ⅰ1min；二甲苯Ⅱ 2min；二甲苯Ⅲ 2min；中性树胶（上海标本模型厂）盖玻片封固；37℃烤干。
3、实验组和对照组培养孔上清酸碱度比较。
4、实验组和对照组吖啶橙荧光染色法[1]：（1）微量加样器吹打实验组和对照组细胞培养孔，使细胞悬起，各吸取1ml Ｈ22细胞悬液至两支2ml离心管中；（2）水平转头离心，2000rpm，离心5min，吸弃干净上清；（3）加20μl吖啶橙(acridine orange,AO，Chroma产品进口分装)基液，再加1mlPBS；（4）振荡混匀，室温5min；（5）离心，条件同上；（6）弃净上清，加10μl PBS，混匀；（7）将此细胞悬液加至一洁净载玻片上，盖好玻片；（8）用荧光显微镜观察，用蓝色激发滤光片；（9）显微摄像系统记录，电脑保存。
5、台盼蓝（北京瀛海精细化工厂）活细胞记数，并计算细胞存活率 。
（二） 实验结果
整个实验中，可见实验组H22细胞生长严重不良，经过3天的培养，对照组细胞大量增殖，细胞密度，包括孔中央密度和周边密度明显高于实验组，细胞数量明显增加，活体细胞形态正常，镜下观实验组细胞数量没有增加，反而减少，细胞形态发生明显改变；吖啶橙染色后经荧光显微镜检测的结果证实实验组细胞失去正常形态和结构，全部死亡，对照组细胞绝大多数正常；HE染色显示对照组均为形态典型的肿瘤细胞，而实验组细胞均为形态不典型的变性坏死细胞；台盼蓝活体染料排除法证明实验组细胞死亡率100%，对照组死亡率10%。上述结果说明再生物质对H22细胞作用是确切的和十分有效的。
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| 1A (×100) |
1B(×400) |
图1 实验第1天H22细胞图片，细胞形态典型。 |
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| 2A(×400) |
2B(×400) |
图2 用药后第一天，实验组和对照组图片。2A为实验组，2B为对照组。实验组细胞形态发生明显改变，细胞已经死亡。对照组细胞形态典型，仍然正常生长。 |
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| 3A(×600) |
3B(×600) |
图3 用药后第二天，实验组和对照组细胞荧光染色图片。3A为实验组，3B为对照组。实验组细胞形态发生明显改变，无细胞核，无细胞结构，说明细胞已经死亡。对照组细胞形态典型，有细胞核（中间高亮区域）和细胞浆，红色为死亡细胞。 |
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| 4A(HE，×400) |
4B(HE，×400) |
图4 用药后第二天，实验组和对照组细胞HE染色图片。4A为实验组，4B为对照组。除少数细胞外，实验组细胞形态发生明显改变，无细胞核，无细胞结构，说明细胞已经死亡。对照组细胞形态典型，细胞核很大，细胞浆少。 |
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