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MEBT/MEBO对血管内皮细胞粗面内质网影响的实验研究

目录
唐乾利¹，郭璐¹，王权胜²，曾娟妮¹，李杰辉²，狄钾骐¹，付军¹，韩珊珊¹

1.广西中医学院，广西　南宁　530001

2.广西中医学院第一附属医院，广西　南宁　530023

［基金项目］2008年国家自然科学基金项目（项目批准号：30860356）及2008年度

　　　广西壮族自治区教育厅科研项目（项目批准号：200810MS173）

【摘要】目的：本课题旨在进一步探讨烧伤湿性医疗技术（MEBT/MEBO）对皮肤溃疡局部血管内皮细胞粗面内质网结构的影响，以期可以从不同侧面揭示MEBT/MEBO的改善微循环、祛腐生肌、促进创面再生与修复作用的分子生物学机制。方法：将40只SPF级SD雄性大鼠随机分为美宝湿润烧伤膏（MEBO）治疗组和贝复济对照组，每组20只，造模后于次日开始用药，观察用药后治疗组和对照组溃疡创面愈合情况、肉芽组织生长情况，并记录创面愈合时间。在造模后第8天，取两组同时相点创面组织，用电镜观察标本的超微结构，主要观察血管内皮细胞中粗面内质网的结构形态。结果：MEBO组大鼠的皮肤溃疡创面愈合情况明显好于贝复济组，创面愈合时间明显短于贝复济组，有显著性差异（P<0.05）。组织病理学检测MEBO组治疗的创面，造模后第8天标本中血管内皮细胞中粗面内质网结构形态多于贝复济组。结论：MEBO较贝复济能明显的缩短实验性SPF级SD雄性大鼠体表皮肤溃疡模型皮肤慢性难愈合创面的修复愈合时间，具有促进创面愈合，减少瘢痕愈合的作用。其部分愈合机制：促进新生毛细血管的增殖等以加速肉芽组织形成。

【关键词】MEBT/MEBO；贝复济；慢性难愈合创面；愈合机制

【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2010.04.001

Experimental Study of Effect of MEBT/MEBO on Rough Endoplasmic Reticulum of Vascular Endothelial Cell. TANG Qian-li¹， GUO Lu¹， WANG Quan-sheng²， et al. 1.Guangxi Traditional Chinese Medicine University， Nanning City， Guangxi Autonomous Region， 530001， China. 2. the First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University， Nanning City， Guangxi Autonomous Region， 530023， China.

　　【Abstract】Objective: To further explore effect of MEBT/MEBO on rough endoplasmic reticulum of vascular endothelial cell at the ulcer wound site， so as to reveal molecular biological mechanisms of MEBT/MEBO in improving microcirculation， removing necrosis tissue and promoting wound regeneration and repair. Method: 40 SD male rats of SPF grade were divided into MEBO treatment group and bFGF control group randomly and evenly (20 for each group). After rats were done as the established model， the medication was applied to the rats at the point of the 2nd day in both two groups. The wound healing process， granulation tissue growth and healing time in two groups were observed and recorded. At the point of 8th day after modeling， the wound tissue samples in two groups were taken in the same time points， and then the ultra-structure of samples was observed with electron microscopy. The key point of observation was structure and morphology of rough endoplasmic reticulum in vascular endothelial cells. Results: Wound healing of skin ulcers in MEBO group was obviously better than that in bFGF group. The wound healing time in MEBO group was significant shorter than that in bFGF group. There was significant differences (P<0.05) in wound healing time between two groups. Conclusion: Compared with bFGF， MEBO can significantly reduce healing time of skin chronic wounds in the experimental SPF SD male rats skin surface model. it can promote wound healing and reduce scar formation. One of the healing mechanisms may be promoting proliferation of new blood capillary so as to accelerate the formation of granulation tissue.

【Key words】 MEBT/MEBO； bFGF； Chronic unhealed wound； healing mechanism

　　发生于体表的慢性难愈合创面主要包括：血管性溃疡、压迫性溃疡、放射性溃疡以及感染性溃疡等。“因其反复发作，长期不愈，形成顽固性难愈性溃疡，愈后又极易复发，少数尚有癌变可能，因此，慢性难愈合创面是临床创面修复的一大难题”^[1]。由于它发生在体表，具有病程长，对外观影响大及并发症多等特点，严重影响患者的生活和工作质量，已引起各国医疗界的高度重视并竞相开展研究^[2^，^3]。近年来，我们在临床上应用该技术治疗多种慢性难愈合皮肤创面，取得了较好的疗效^[4]。本实验旨在中医外科学理论指导下，在前期研究和临床应用的基础上，综合应用分子生物学、超微病理学、生物化学等现代多学科研究技术，进一步探讨MEBT/MEBO对皮肤溃疡局部血管内皮细胞粗面内质网结构的影响，以期可以从不同侧面揭示MEBT/MEBO的改善微循环、祛腐生肌、促进创面再生与修复作用的分子生物学机制，并期望开辟“促进血管、细胞生长，加速创面愈合”的治疗新途径，为皮肤溃疡的治疗提供新的思路和有效治疗的新方法。

1.主要实验材料和实验方法

　　实验动物：SPF级SD雄性大鼠，2月龄，40只，体质量200g ~250g（由广西医科大学动物实验中心提供）。美宝湿润烧伤膏（MEBO）（北京光明中医烧伤创疡研究所监制，汕头市美宝制药有限公司生产，规格：40g/支。）；贝复济：即外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子——bFGF（由珠海亿胜生物制药有限公司生产，规格：63000iu/15ml/瓶。）。实验全过程使用同批号药物。

2.实验步骤及方法

2.1.实验动物分组及换药方法

　　将40只SPF级SD健康雄性大鼠随机分为2组（每组20只）：MEBO组为治疗组，贝复济组为对照组。参照付小兵等^[5]全层皮肤缺损法和沈氏改良塑料环肉芽肿定量法^[6]经改进制成大鼠慢性难愈合创面模型。大鼠背部剃毛，面积约7cm×5cm。选择大腿臀部脊柱两侧，用直径18mm的环钻垂直于皮肤各压出1个圆形痕迹（ 2.54cm²），剪去全层皮肤（深达筋膜），制成圆形创面，止血备用。每只大鼠制备2个创面，加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”形固定。造模后即刻注射醋酸氢化可的松（8mg/100g体重）；每日予青霉素40万U肌肉注射，连续4天，建成慢性难愈合创面模型。

　　两组于造模后次日开始换药。MEBO组清除创面坏死组织及液化物后，创面外敷湿润烧伤膏纱布，按创面大小剪成小块贴于创面上，然后在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定，1次/日。贝复济组以1/5000呋喃西林溶液清洁创面后，创面外敷贝复济浸透纱布（60U/cm²），按创面大小剪成小块贴于创面上，然后在创面上加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定，1次/日。大鼠分笼饲养，自由进食进水。

2.2.标本采集

　　各组均于换药后第8天，将动物用氯胺酮麻醉处死，取相同部位创面新生肉芽组织为所需实验样品。用于电镜观察的创面新生肉芽组织，取同时相点创面组织，加电镜固定液固定。

2.3.观察指标和检测方法

　　每日换药时观察创面愈合情况，如：创面水肿渗出程度、是否干燥、有无分泌物、创周红肿变化、创面肉芽组织生长情况及创面愈合时间等。固定后的创面组织，送电镜室脱水、包埋、切片后置透射电镜下观察标本的新生血管内皮细胞粗面内质网情况。

2.4.统计学处理

　　数据以均数±标准差（x(_)±s）表示，用 SPSS13.0软件进行方差分析，P<0.05为有显著性差异，具有统计学意义。

3.结果

3.1.创面愈合时间

　　MEBO组创面较贝复济组提前两天出现加速愈合的趋势。MEBO组创面完全愈合所需时间为16.16天±1.16天，优于贝复济组的18.00天±0.89天，有显著性差异（P<0.05），具有统计学意义（见表1）。表明MEBO具有促进大鼠体表皮肤溃疡创面愈合的作用。

表1大鼠皮肤溃疡创面愈合时间比较（x(_)±s）

组别

n（只）

愈合时间（天）

MEBO组

20

16.16±1.16^△

贝复济组

20

18.00±0.89

注：MEBO组与贝复济组相比^△P<0.05

3.2.创面大体情况观察

　　造模后所有动物全身情况良好，活动正常，所有创面均有出血、渗出和周围组织水肿。创面用药后第7天，MEBO组创面水肿消退，创面湿润洁净，无坏死组织，创面周边及基底部可见鲜红的肉芽组织，呈颗粒状，触之易出血，渗出液较多，呈淡黄色，稀薄，可见淡红色新生上皮由四周向创面中心生长。贝复济组创面干燥结痂，暗红色，渗出较少，创面周围新生上皮逐渐向中心生长，生长稍慢；部分大鼠创面感染坏死。（见图1，图2）

　　用药后第14天，MEBO 组创面已很小，上皮生长较快，部分创面已接近愈合，可见较多毛发长出。贝复济组创面明显缩小，上皮生长略慢，有少量毛发长出。（见图3，图4）

　　以上各期，MEBO组溃疡面始终保持湿润，贝复济组创面干燥结痂，并有部分创面发生感染。（见图5，图6）

　　实验中观察到，各组创面愈后均无明显突起于皮表的瘢痕， MEBO组瘢痕皮色接近正常皮色，稍暗，弹性接近正常皮肤；贝复济组的瘢痕皮色暗红，弹性差。可见MEBO组瘢痕形态最接近正常皮肤形态，说明MEBO有减少瘢痕形成的作用。

3.3.创面组织形态学观察
　　电镜观察结果中可以看到，同时相点的创面组织，MEBO组血管内皮细胞粗面内质网的形态明显多于贝复济组。慢性难愈合创面模型大鼠肉芽组织中存在大量的胶原纤维且毛细血管管腔变窄，血管内皮细胞退化，胞浆空泡变性，细胞器减少、肿胀，核染色质浓缩。MEBO组换药后第 3天～14天分别可见成纤维细胞数量明显增多，创面肉芽组织中可见大量成纤维细胞，胞体大，核内染色质分布均匀，核仁明显，胞浆内有丰富的粗面内质网，内质网池轻度扩张，池内含有均匀的低电子密度物质，说明蛋白质、基质等合成旺盛，细胞处于功能旺盛状态；细胞周围可见到大量的胶原纤维，成纤维细胞间还可见新生的毛细血管，其内皮细胞较厚，略呈扁平状核仁2个～3个，内质网扩张，线粒体增大，成纤维细胞、巨噬细胞和肥大细胞有桥粒连接；毛细管数目多，管腔扩张，内有红细胞。（见图7~图14）

4.结论

　　在本实验中，MEBO相对于贝复济能明显缩短实验性SPF级SD雄性大鼠体表皮肤溃疡模型皮肤慢性难愈合创面修复愈合时间，具有促进创面愈合的作用。通过本实验中创面肉芽组织血管内皮细胞中粗面内质网形态变化反映出其部分愈合机制为：促进新生毛细血管的增殖等作用以加快肉芽组织形成。且通过本动物实验观察，MEBO在促进大鼠创面愈合，缩短创面愈合时间，减少瘢痕愈合方面优于贝复济。

5.分析与讨论

　　慢性难愈合创面属中医学“溃疡”范畴，是中医外科的常见病、多发病。中医学对其治疗有着悠久的历史和良好的疗效，不仅积累了丰富的临床经验，总结了卓有疗效的大量方药和有关剂型，并且上升到理论高度，确定了溃疡形成的病因病机和辨证论治的方法，形成了具有中医特色的皮肤溃疡诊治理论体系。近年来，我们在临床上应用该技术治疗多种慢性难愈合皮肤创面，取得了较好的疗效^[4]，治愈了大量难治性皮肤溃疡，较之西医传统的植皮愈合和中医传统上使用含汞、砒的腐蚀丹药“腐”而后“收”的应用，体现出更好的实用价值，并减少了并发症。此外还进行了MEBO对皮肤溃疡修复作用的实验研究，结果表明MEBO能明显的缩短实验性大鼠体表皮肤溃疡创面修复愈合时间，具有促进创面愈合的作用，对于修复创面肉芽组织中新生毛细血管和成纤维细胞数量与形态具有良好的调节作用。从祖国医学的角度来说，皮肤溃疡病机演变的特点为：因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损，形成了虚、邪、瘀、腐相互作用，互为因果的变化。

　　尽管慢性难愈合创面不会立即威胁生命，但却能导致众多并发症，严重影响伤员的后期康复和生活质量。创面处理贯穿于整个治疗的始终，是该领域最重要、最基本的问题之一。近20余年来，由于干细胞、组织工程和基因工程等高新生物技术的发展及其在创（烧）伤救治中的应用，使得创面处理的临床研究不断深入，治疗取得了突破性进展，尤其是手术方法的改进，如皮瓣转移、植皮、截趾、新型敷料、酶类制剂以及负压引流、干细胞治疗等，但对于慢性皮肤溃疡，手术治疗只是在控制和纠正病因基础上的一种辅助治疗手段。因此，对于难治性溃疡的治疗非手术疗法仍是临床首选^[8]。

　　MEBO主要由数十种天然中药精制而成，能清热解毒祛邪，直接祛除病因，用于病灶处，易于取效。其中活血祛瘀药物可直达病所，加上其中含有祛腐生肌的成份，能祛除局部的腐肉和邪毒，达到腐去新生之效；而药物中的补益之品、营养成份则扶正补虚，为创面组织的再生修复提供营养原料。总之，本药组方符合中医理法原则，从而能起到加速创面愈合的作用。另一方面，MEBO的营养成份由低分子的蛋白质、脂肪和糖组成，可以直接作用在溃疡创面，并在局部被组织吸收，为创面组织的再生修复提供营养原料；药物成份则完成了创面的止痛、抗感染、减轻炎症和减轻瘢痕等治疗作用。MEBO能有效阻止创面水份蒸发，保持创面湿润，有效地保护创面，使其维持在一个低氧张力的环境中，有利于毛细血管扩张，增加局部血流，防止微血栓生成^[9]，避免了包扎压迫、干燥脱水等影响，保护了间生态组织，使间生态组织恢复生机，并能防止细菌入侵。

　　贝复济（bFGF）系外用重组牛碱性成纤维细胞生长因子，其对于来源于中胚层和外胚层的细胞（如上皮细胞、真皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等）均有促进修复和再生的作用，同时还可改善溃疡局部的血液循环，促进毛细血管再生，加速创面愈合。但bFGF的不足之处是：（1）因bFGF无法穿透坏死组织作用到皮肤附件上的上皮细胞，所以应用bFGF应在表层坏死组织清除或脱落后，每次换药时均需清理创面坏死组织，加重了疼痛。（2）bFGF不仅无止痛作用，而且对创面有一定的刺激性。（3）bFGF不含抗生素，需联合应用抗生素，应用bFGF最佳条件是在创面感染控制的情况下。（4）bFGF要求无菌操作，需专业人员进行，药物需冷藏保存。（5）应用bFGF治疗，愈合创面的皮肤较薄，以表皮为主，只有少量的真皮组织，易出现瘢痕挛缩^[10]。

　　现代研究证明，皮肤溃疡创面修复是一个复杂而有序的病理过程，其基本过程是肉芽组织增生。创面的肉芽组织形成，填充组织缺损，有利于增强创面的抗感染能力，有利于肉芽组织在创面发生收缩，有利于创面愈合，并为上皮爬生创造了必要条件。肉芽组织主要由成纤维细胞和新生毛细血管构成。毛细血管内皮细胞和成纤维细胞增殖能力的增强，可明显促进肉芽组织增生，同时细胞能分泌许多功能蛋白质，可促进创面收缩和创面扩张的能力^[11]，所以毛细血管和成纤维细胞的多寡决定着溃疡愈合时间的长短。因此，血管生成是创伤愈合过程中的重要一环，血管病损所致的低氧血症是限制创面修复的关键因素之一；慢性难愈合创面往往都伴有血管的异常^[12^，^13]。新生血管的形成可为创面的修复提供充足的氧分，有利于细胞的增殖；新生血管是肉芽组织的主要成份，而肉芽组织是胶原沉积、改建的场所，因此，血管新生是创面修复过程中重要的一环。血管新生一方面由原血管床血管外膜降解，血管内皮细胞迁徙、增殖改建而成；另一方面由创面床内皮祖/干细胞增殖、分化形成。

　　其中，血管内皮细胞（endothelial cell，EC）是血管各种生理病理反应的基础^[14]，而在皮肤溃疡中内皮细胞受损是引发微循环障碍的主要病因，因此，内皮细胞是受损机体、组织和器官修复的关键因素。电镜下可见内皮细胞内含有非常发达的高尔基体、粗面内质网和滑面内质网，其中再生血管内皮细胞更为明显。粗面内质网是内皮细胞合成和分泌血管活性物质的主要部位之一。粗面内质网常见于蛋白质合成旺盛的细胞中，例如消化腺上皮细胞、肝细胞等。粗面内质网大多呈扁平膜囊状，在电镜下观察排列极为整齐，少数为球形或管状囊泡。粗面内质网与蛋白质的合成密切相关，它既是核蛋白体附着的支架，又是运输蛋白质的通道。本实验中处在分泌和增殖期的细胞可见到细胞胞浆内粗面内质网膨大，有大量的核蛋白颗粒，呈现高电子密度电子云。

　　综上所述，MEBT/MEBO可通过促进血管内皮细胞分裂增殖，加快微小血管形成，改善创面的血液循环，营养创面等来提高机体本身的修复能力，并可创造一种既利于修复，同时又不破坏正常组织修复进程的生理环境，促进难愈合创面愈合，有效地预防或减少瘢痕形成，提高愈合质量。随着生物技术的发展，以生理性再生修复为基础，追求无瘢痕的创面愈合方式，已成为创面愈合研究的趋势和主导潮流。我们应当在发扬中医药优势的同时，借助于现代的高科技及生物学成果，对中医药促进创面生理性修复及组织再生的机制进行深入系统研究，开发符合国际标准和要求的应用于创面修复愈合的疗法，发展中医外治法，为传统中医药对该病的防治提供可靠的理论依据，新的技术方法和研究思路。

参考文献

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【作者简介】

唐乾利（1961~），本文通讯作者，男（汉族），广西桂林市人，1983年毕业于广西中医学院，中西医结合研究生学历，外科教授、主任医师，硕士研究生导师，主要从事普外科、烧伤外科专业，广西中医学院外科学学科带头人.

郭　璐（1982~），女（汉族），山西长治市人，2007年本科毕业于山西中医学院， 2007级广西中医学院硕士研究生，现为广西中医学院第一附属医院胃肠腺体外科住院医师，主要研究方向：中医外治法研究.
王权胜（1975~），男（汉族），广西博白县人，医学博士，广西中医学院2003级中西医结合烧伤外科学研究生，研究方向为烧伤湿性医疗技术及中西医结合男性疾病防治，现为广西中医学院第一附属医院中西医结合外科主治医师.

组别	n（只）	愈合时间（天）
MEBO组	20	16.16±1.16^△
贝复济组	20	18.00±0.89

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