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中国烧伤创疡科技中心(100053)　徐荣祥　许增禄

[摘要]　目的：探索烧伤湿性医疗技术于浅Ⅲ度烧伤时脂肪层烧伤创面自然修复的机制。方法：应用细胞免疫化学方法生物素抗生物素蛋白(biotinavidi n)DCS体系间接免疫荧光技术。以小鼠抗人角蛋白19的单克隆抗体检测表皮再生干细胞。结果：烧伤后24h可见表皮再生干细胞出现。烧伤后4天表皮再生干细胞数量增多。烧伤后7天和14天表皮再生干细胞数量最多。烧伤后21天和28天表皮再生干细胞减少。结论：烧伤湿性医疗技术对浅Ⅲ度烧伤残余组织中的再生表皮干细胞具有促进其激活和增生的作用。

[关键词]　烧伤　湿性医疗技术　表皮干细胞　细胞免疫化学

The Effect of MEBT on Epidermal Regenerative Stem Cells Xu Ronxiang, Xu Zenglu, China National Science and Technology Center for Burns, Wounds and Ulce rs, Beijing,100053

[Abstract]　Objective:To investigate the mechanism of the effect of M EBT on the s pontaneous repair of fatty layer burn wound of superficial third degree burn. Me thod: Immunocytochemistry method---biotin-avidin DCS system, indirect immunofluo rescence technique (IFT) was applied. Mouse antihuman type 19 keratin monoclona l antibody (McAb) was used to detect epidermal regenerative stem cells. Results: Epidermal regenerative stem cells emerged in 24 hr post burn and the number of epidermal regenerative stem cell increased on day 4 post burn. On days 7 and 14 post burn, the number of epidermal stem cells increased to the peak. On days 21 and 28 post burn, the number of epidermal stem cells decreased. Conclusion: MEBT has the effect of promoting the activation and proliferation o f regenerative epidermal stem cell in the residual surviving tissue of superfici al third degree burn wounds.

[Key words]　Burn　MEBT　Epidermal stem cell　Immunocytochemistry

烧伤湿性医疗技术是烧伤治疗学上的具有创新性的治疗学术体系。目前已成功并普及推广的 治疗技术为烧伤湿润暴露疗法与湿润烧伤膏。在临床上成功地解决了烧伤创面的疼痛、创面 感染、创面的进行性坏死、烧伤深Ⅱ度创面的瘢痕愈合等四大国际烧伤难题。最近又取得了 在Ⅲ度烧伤创面脂肪组织上再生皮肤的成果。深Ⅱ度烧伤和浅Ⅲ度烧伤使损伤的皮肤不再存 留表皮基底层的干细胞。因此，使脂肪层烧伤创面自然修复的表皮再生干细胞的来源确实是 值得深入研究的。

资料与方法

1.取材　以下2例患者受伤后立即采用烧伤湿性医疗技术治疗。

第1例：6岁男孩，热水烫伤，背部、双下肢。烫伤面积达33%。深Ⅱ度烫伤。

第2例：24岁男性青年，火焰烧伤四肢。烧伤面积25%，深Ⅱ度、浅Ⅲ度烧伤。

以上2例于正常部位及伤后24h、4天、7天、14天、21天、28天患处取皮肤或组织。立即放入 冻存管于液氮中保存。然后放入OCT冷冻剂复合物(TissueTek OCT Compound)中包埋，于 液氮中冷冻。恒冷箱冰冻切片，厚度10μm。

2.生物素一抗生物素蛋白DCS体系间接免疫荧光染色　先将冰冻切片用10%的马血清于4℃孵 育20min，然后滴加1∶20稀释的小鼠抗人角蛋白19型单克隆抗体(第1抗体)4℃孵育过夜。切 片在磷酸缓冲液中涮洗后加第2抗体，即7.5μg/ml生物素化的马抗小鼠IgG抗体(Vector Lab oratories Burlingame, CA, USA),4℃孵育1h。涮洗后，加10μg/ml荧光素抗生物素蛋白 DCS(Vector Laboratories Burlingame, CA, USA)于4℃孵育1h。将切片涮洗干净后，用含1 0%PBS和1%对苯基二胺(Pphenylenediamine)的甘油做介质封片。对照染色切片，则不加第 1抗体。标本在Olympus反射式荧光显微镜下观察，并用ASA400 KODAK胶卷照相。

结果

用特异的小鼠抗人角蛋白19型的单克隆抗体(McAb)对正常和烧伤皮肤免疫细胞化学观察结果 表明，两例正常皮肤表皮再生干细胞数量较少，可见少量显示荧光的表皮细胞再生干细胞( 图541)，即角蛋白19型阳性细胞。烧伤后24h，荧光显微镜下，显示荧光的表皮再生干 细胞数量中等程度(图542)，烧伤后4天，在汗腺、毛细血管和毛囊周围可见开始增多的 潜在表皮干细胞(图543)。烧伤后7天(图544)，烧伤后14天(图545)，在该两时 间点镜下可见比烧伤后4天继续增多的表皮再生干细胞。潜在的再生干细胞即含人角蛋白19 型细胞的数量达到烧伤疗程中的峰值(数量最多)。至烧伤后21天(图546)和28天(图54 7)两时间点潜在再生干细胞数量又减至一定的水平。观察中发现患者经湿性烧伤医疗技术 治疗后，潜在再生干细胞的增生状态有一定的变化规律。潜在再生干细胞可能是表皮再生的 干细胞的来源，这些在荧光显微镜下显示荧光的细胞是深Ⅱ度和浅Ⅲ度烧伤后还存在的潜在 的表皮再生干细胞。这些细胞可使烧伤湿性医疗技术治疗的深Ⅱ度烧伤无瘢痕愈合，浅Ⅲ度 烧伤皮肤再生。

讨论

国际上对细胞周期的深入研究表明，细胞周期与生理性再生、创伤修复有密切的关系。有些 细胞长期停滞于G0期或G1期，在一定条件下才出现增生活动。有些细胞可持续进行分裂 活动 ，分裂后的部分子细胞分化为执行一定功能的成熟细胞，部分子细胞则一直保持连续增生能 力，称干细胞。皮肤表皮基底层干细胞可不断进行分裂，新生的细胞向上方移动，在到达棘 层深部时可再分裂二或三次，然后失去细胞分裂能力。

深Ⅱ度和浅Ⅲ度烧伤损伤了皮肤表皮和真皮深层，表皮基底层的干细胞全部受到破坏。残存 于皮下组织的毛囊、汗腺，以及毛细血管周围的间充质细胞都有可能提供表皮再生的干细胞 。由于这些再生干细胞能合成特有的细胞角蛋白(19型)，所以可采用免疫细胞化学方法辨认 这些细胞。我们的研究采用了抗人角蛋白19型单克隆抗体，应用生物素抗生物素蛋白DCS 体系间接免疫荧光技术，能够准确、特异地检测出深Ⅱ度和浅Ⅲ度烧伤后残存于皮下组织的 表皮再生干细胞。经过烧伤湿性医疗技术治疗后，于烧伤后7天至14天阶段，潜在的再生干 细胞即显示人角蛋白19型免疫组织化学标志物的细胞数量达到峰值。这些显示间接免疫荧光 的细胞就是供脂肪层烧伤创面自然修复的表皮再生干细胞。由于烧伤湿润暴露疗法与湿润烧 伤膏的治疗作用，可能激活了休眠状态的潜在的表皮再生干细胞的增生。这有力地保证了深 Ⅱ度或浅Ⅲ度烧伤，经烧伤湿性医疗技术治疗后，达到烧伤创面自然修复、无瘢痕愈合的疗 效。该技术解除了烧伤患者的瘢痕伴随终生的痛苦。

表皮再生干细胞在移动和进行细胞分裂后，发生合成其他类型角蛋白(9型和16型)的细胞， 这些细胞仍有移动能力。然后，它们分裂增生成的细胞合成较硬的角蛋白(1型和10型)，这 是成熟的表皮细胞所含的典型角蛋白。由此体现了烧伤湿性医疗技术对表皮再生干细胞具有 促进其激活和增生的作用。

研究表明细胞从静止期释放出来，首先被激活的周期蛋白就是cyclin D，只有受到生长因子 刺激后，它才表达。真核细胞生物在细胞的G1期决定进入增生状态还是退出周期。G1期 限制点的主要调控者是cyclin D1/CDK4复合体。为了深入研究烧伤湿性医疗技术疗效作 用机制，我们将进一步探索表皮再生干细胞细胞周围期的基因调控。