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摘　要：目的：探讨烧伤导致巨噬细胞功能异常的发生机制。方法：测定了严重烧伤小鼠腹腔巨噬细胞(PMΦ)磷酯酶C(PLC)、甘油二酯(DAG)、蛋白激酶C(PKC)的活性，三磷酸肌醇(IP3)、钙离子(Ca^2＋)、TNF的变化，以及PKC抑制剂H-7和钙调素(CaM)拮抗剂W-7对TNF产生的影响。结果：上述所观察的指标在严重烧伤后6hr、12hr、24hr、都发生了非常明显的变化，PKC抑制剂H-7能够显著地抑制TNF的产生。结论：腹腔巨噬细胞肌醇脂质信号系统是促使TNF分泌的主要信号途径之一，在肌醇脂质信号系统中以DAG-PKC的信号途径与TNF分泌关系更为密切。
关键词：烧伤　巨噬细胞　TNF

Changes of Inositol Lipid Signal System and Its Effect on the Secretion of TNF of Peritoneal Macrophage Following Severe Scald in Mice Wang Xinmin et al.(Kunming General Hospital, Chengdu Military Area 650032 Peng Daizhi et al. Institute for Burns, PLA No. 3 Medical University 400035)

Abstract：Purpose:To further study on the mechanism of abnormal macrophages functional changes postburn, insositol lipid signal system and its effects on TNF secretion by peritoneal macrophages (PM() were observed in severely scalded mice. Method: The activity of PL C (phospholipase C), DAG (diacylglycerol), PKC (protein kinase C), and the alternations of IP3 (inositol-1, 4, 5,-triphosphate), Ca2+ and TNF (tumor necrosis factor) in PM( were measured, and the effects of H-7 (1-(5-isoquinolineslfony1)-2-methylpierazine, a specific PKC inhibitor) and W-7 (N-6-amino-hexyl-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide, CaM antagonist) on the production of TNF were also observed. Result: It showed that all above-mentioned parameters changes significantly at 6h,12h,24h postburn. There were remarkable decreases of TNF by using H-7. Conclusion: The results suggested that the inositol lipid signal system of PM( is one of the main signal systems participating in the secretion of TNF, and in this system the DAG-PKC signal pathway showed closer relationship than IP3-Ca2+ in the TNF production.
Keywords：Burn　Macrophage　TNF▲

严重烧伤后早期机体免疫功能严重紊乱^［1］，巨噬细胞在其中可能起着十分重要的作用。机体的免疫紊乱和脏器损害与巨噬细胞分泌过量TNF、白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、前列腺素E₂（PGE₂）等炎症介质有关，在这些炎症介质中以TNF的作用表现最为突出，烧伤后尤其是严重烧伤后机体产生过量的TNF不仅介导机体的炎症过程，而且还是导致脓毒性休克、多器官功能衰竭的重要原因之一^［2］。因此，研究烧伤后巨噬细胞分泌过量TNF的原因，可能对伤后早期巨噬细胞功能变化及伤后出现的免疫紊乱有着重要意义。本实验以严重烫伤(烧伤)小鼠为模型，通过测定PLC、IP₃、Ca^2＋、DAG、PKC、TNF的变化，以初步分析严重烧伤PMΦ肌醇指质信号系统的变化及其对TNF分泌的作用。

资料与方法

一、实验动物　健康昆明小白鼠，雌雄各半，随机分组，体重24±1.2g，由第三军医大学动物实验中心提供。
　　二、方　法
　　1.模型制作：背部剪毛固定，清醒状态下高压热蒸汽造成体表面积18%Ⅲ度烫伤(病理切片证实)。致伤条件：蒸汽压力为10-12kg/cm²，距离4cm，作用时间10秒。伤后立即腹腔注射生理盐水3ml抗休克。
　　2.实验分组：按烫伤后不同观察时间而分成2hr、6hr、12hr、24hr、48hr及正常对照6个时相组。对照组、各时间组n=8。
　　3.PMΦ获取：小鼠按不同时相点采用腋下放血处死。以冷的PBS灌洗腹腔获取腹腔细胞。50g离心5分钟后，压积的腹腔细胞用含10%小牛血清的RPMI1640液悬浮，以Pecoll液分离纯化PMΦ，纯度大于85%，存活率大于95%(酯酶染色证实)，调MPΦ浓度为10⁶cells/ml。
　　4.PLC活性的测定：提取PMΦ的PLC^［3］，用高灵敏度的磷测定法测定无机磷的含量^［4］。即可知PLC的活性。
　　5.IP₃的测定：按文献^［5］略加改进，用〔³H〕-inositol标记PMΦ，阴离子交换层析柱分离IP₃，测其液闪放射计数。
　　6.钙离子（Ca^2＋）的测定：采用荧光探针Fura-2/AM的测定法^［6］。
　　7.DAG测定：按文献^［7］略加改进。DAG和［r-³²P］ATP在DAG激酶作用下生成³²PA。薄层层析法分离³²PA，测其放射性计数。
　　8.PKC的测定^［8］：提取PKC；PKC摧化底物组蛋白(Ⅲ-S型)磷酸化；测定［r-³²P］ATP掺入组蛋白的³²P的放射性，便可计算PKC的活性。单位为nmol/min.mgprotein。
　　9.TNF生物活性法测定^［9］：TNF有杀肿瘤细胞的能力，杀死后的细胞用结晶紫染色不着色，用酶标仪分别测其OD值，按公式计算TNF杀伤率，公式如下：

三、统计学处理
　　对实验数据用±S表示，均用华西医科大学统计程序包作单因素方差分析，进行显著性检验。

结　　果

一、PLC、DAG、IP₃、Ca^2＋、TNF的变化
　　PLC、DAG、IP₃、Ca^2＋、TNF均在伤后12hr、48hr非常显著地高于对照组(P＜0.01)；PLC在伤后6hr却非常显著地低于对照组；DAG和TNF在伤后48hr仍显著高于对照组。(表1)。

二、 W-7和H-7对TNF产生的影响
　　由于我们所观察的指标均于伤后12hr发生了非常明显的变化，故选用伤后12hr时相，观察了钙调素拮抗剂W-7和PKC抑制剂H-7对PMΦ分泌TNF的影响。结果显示，H-7能够显著地抑制PMΦTNF的分泌，而W-7对TNF的产生则无统计学意义(表2)。

讨　　论

外部信号作用于细胞表面受体，通过G蛋白的偶联作用，激活PLC，引起膜连接的磷酯酰肌醇-4、5-二磷酸(PIP₂)水解，产生两个第二信使物质IP₃和DAG。IP₃促使内质网中Ca^2＋的释放，升高的Ca^2＋和钙调素结合，引起细胞效应；另一个第二信使物质DAG使胞内PKC活化，活化的PKC和底物蛋白结结合引发相应的细胞效应。在本实验中，PLC、IP₃、Ca^2＋、DAG、PKC在6、12、24、48PBH发生了非常明显的变化，表明严重烧伤后小鼠PMΦ肌醇脂质信号系统被明显激活，表现为不同的活化状态。
　　PLC的主要作用是引起PIP₂水解。我们实验中观察到PLC在伤12hr、24hr显著高于对照组，而伤后6hr、48hr却显著低于对照组(表一)，PLC活性的显著升高，可能是由于PMΦ在受到外部信号刺激后PLC被大量激活所致。而PLC在6、48PBH活性的显著降低的原因，可能是PLC被激活后过度消耗而暂时处于一种“耗竭”状态，也可能是受到升高的PKC的抑制。Humiler曾证实升高的PKC对PLC有抑制作用。在本实验中PKC在48PBH仍处于显著增高的水平，但PKC在伤后6hr却变化不明显，是否在2PBH到6PH之间还有一个过度活化过程，尚不清楚。
　　IP₃是PLC水解PIP₂产生的两个第二信使物质之一。我们实验表明，IP₃在伤后6hr就显著升高（P＜0．01）。一直持续到伤后48hr才开始下降，Ca^2＋的变化与IP₃存在着显著的正相关系(r=0.946,P＜0．01）。提示胞内钙离子［Ca^2＋］i；与IP₃有着密切的联系。细胞内游离钙离子浓度的改变是反映细胞激活的早期生化事件之一，我们观察到［Ca^2＋］i；在伤后6hr到24PBH逐步增高，24PBH达到峰值，到48PBH又降至近对照组水平，说明严重烧伤后小鼠PMΦ在不同时相是处于不同的激活状态，表现为被逐步激活，达到高度活化，甚至可能是过度活化(伤后48hr［Ca^2＋］i，又降到近对照组水平，而在此时相点所检测的IP₃、DAG、PKC、TNF却仍是显著地增高)。
　　DAG是PLC水解PIP₂产生的另一个第二信物质。DAG在PS(磷酯酰丝氨酸)和Ca^2＋的共同存在下使PKC活化^［10］。在本实验中DAG和PKC，二者均在伤后12hr显著升高，一直持续到伤后48hr。
　　综上所述，说明小鼠严重烧伤后早期PMΦ(24PH内)被逐步激活，达到高度活化；肌醇脂质信号系统及其所介导的两条信号途径IP₃－Ca^2＋途径及DAG-PKC途径均被明显激活。
　　为进一步确定TNF与肌醇脂质信号系统及其所介导的两条信号途径的关系，使用钙调蛋白拮抗剂W-7和PKC抑制剂H-7分别作用于PMΦ后检测TNF，结果发现PKC抑制剂H-7能够使PMΦ分泌TNF显著降低，而钙调蛋白拮抗剂W-7则无作用(表2)。说明DAG-PKC信号途径介导了TNF的产生，IP₃－Ca^2＋途径则无明显效果，因此，严重烧伤后早期巨噬细胞肌醇脂质信号系统的激活可能是TNF产生过量的重要原因之一。且在肌醇脂质信号系统中以DAG-PKC信号途径与TNF关系更为密切。

参考文献：