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［摘　要］目的：探索白念珠菌特异性IgY对烧伤鼠继发感染白念珠菌的预防作用。方法：自烧伤继发感染白念珠菌病人创面分离出的白念珠菌免疫蛋鸡，并将从该鸡产的蛋中分离出提取的特异性IgY用于烧伤感染白念珠菌大鼠。结果：特异性IgY能明显抑制烧伤鼠创面(痂下组织)继发感染白念珠菌，与对照组比有显著性差异。结论：白念珠菌特异性IgY有助于烧伤鼠预防白念珠菌的继发感染

［关键词］白念珠菌　IgY　烧伤　预防

Experimental Study of the Effect of Specific IgY on Preventing Burned Rats from Secondary Infection of Candida Albicans Fu Yingyuan, Cao Yong, Yang Hui, et al.(Dept. of Immunology, Jiangxi Medical College, Nanchang 330006)

［Abstract］Objective: To investigate the effect of specific IgY on preventing burned rats from secondary infection of candida albicans. Method: The specific IgY against candida albicans was extracted from the yolk of eggs laid by the hens immunized by candida albicans isolated from burned patients with secondary infection of candida albicans. Burned rats infected with candida albicans were divided into 2 groups. Rats in one group were treated with IgY and rats in the control group were treated with saline. Results: Compared with the control group, the specific IgY was effective for preventing secondary infection of candida albicans in rats. The difference between the two groups was statistically significant. Conclusion: Specific IgY is effective for preventing burned rats from secondary infection of candida albicans.

［Key words］Candida albicans　IgY　burn　prevention

白念珠菌属条件致病性真菌，也是烧伤、肿瘤、器官移植、爱滋病等免疫功能低下病人的主要感染性微生物^［1］。近20年来，白念珠菌在临床真菌感染中已跃居第一位，其病死率高达60～90%^［2．3］。加上各种新的广谱抗生素投放市场，临床上多种抗生素的同时应用，导致菌群失调，造成原本抵抗力下降的各种疾病患者极易继发感染念珠菌。为此本课题组研究制备出抗白念珠菌特异性IgY，并以烧伤大鼠为模型，观察其在烧伤鼠感染白念珠菌中的预防作用，为临床预防白念珠菌感染提供有效的实验依据。

材料与方法

1.白念珠菌抗原制备：自我院烧伤中心临床烧伤继发感染白念珠菌患者多处创面分离出白念珠菌，经形态学和生化鉴定后，进行纯培养，将其配成适当浓度菌液后超声粉碎。
　　2.抗白念珠菌特异性IgY的制备；
　　(1) 免疫产蛋母鸡：选健康产蛋母鸡(美国引进良种鸡)隔离饲养三天后，将上述抗原等量辅以不完全佐剂，于蛋鸡多处皮下注射，两周后，用单纯抗原于蛋鸡腋下静脉加强免疫一次。在第一次免疫后，开始收集鸡蛋，储于4℃冰箱备用。
　　(2) 特异性IgY的提取与纯化；采用水稀释法^［4］粗提IgY，尔后用DCAE-Sephdex A50离子交换层析纯化，并用LowrY's法测其蛋白含量。
　　(3) IgY活性测定；采用间接血凝法和补体结合试验。
　　3.实验动物及饲养：实验选用健康SD大鼠(江医动物中心)30只，体重190±10g，雌雄各半，室温23±3℃，实验前在江医烧伤中心实验室单笼饲养三天。
　　4.动物分组：实验动物随机分成三组，单纯烧伤组(简称对照组)；烧伤感染组(简称感染组)，即烧伤后创面人工行白念珠菌感染；烧伤感染IgY预防组(简称IgY组)，即烧伤后创面人工行白念珠菌感染再用特异性IgY。
　　5.动物模型制作：
　　(1) 白念珠菌悬液的制备：将前述菌新鲜接种于沙保氏培基上72h后，用无菌NS洗下后再洗涤一次，用比浊法调整细菌浓度为2．5×10⁵CFU／ml,4℃保存备用。
　　(2) 抗白念珠菌特异性IgY配制：取预先制备的干燥IgY用无菌NS按1：100浓度稀释后，置4℃保存备用。
　　(3) 烧伤大鼠制作：按常规方法，根据大白鼠体表面积计算公式(S＝K*3W²)计算出总面积，并作好背部预烧伤面积标记，称重，氯胺酮麻醉后，用8%硫化钠脱毛，再在100℃沸水中浸泡10″，造成25%～30％Ⅲ度烫伤。
　　(4) 烧伤感染大鼠制作：感染组：烧伤后，即腹腔注射NS(4ml/100g)以抗休克，烫伤创面用无菌纱布擦干，1h后均匀涂布1ml菌液，待创面吸收，第3h后按常规烧伤治疗(创面涂布磺胺嘧啶银霜剂)再用无菌纱布包扎，单笼饲养，常规饮食、自由饮水。IgY组：烧伤后即腹腔注射NS(同前)，第1h后涂布菌液，第2h后创面均匀涂布1mlIgY，第3h后同感染组。对照组：烧伤后立即腹腔注射NS，亦于第3h后按常规治疗，方法同感染组。
　　6.取材与观察指标：
　　(1) 痂下细菌学检查：活杀大鼠后，无菌条件下，切取深度烧伤痂下组织，称重后匀浆组织使成匀浆液，再取10ul接种于沙保氏培基上30℃孵育72h，根据培基上生长的菌落数按公式［每克组织细菌量(CFU/g)=菌落数×稀释倍数÷组织重量］计算细菌总量。
　　(2) 血液及脏器的组织培养；活杀大鼠后，立即常规消毒胸腹部，无菌采心血，切取肝、脾、肾，定量匀浆后分别接种于增基上30℃，72h后观察结果。
　　(3) 脏器的大体检查及病理切片；上述脏器取出，先行大体检查，再切取部分作细菌检查，剩余部分用固定液固定后作病理切片。

结　　果

1.烧伤48h后痂皮白念珠菌培养：如表1所示，IgY预防组白念珠菌检出率，明显降低，与感染组比有非常显著性差异。据有关资料表明，痂下菌量为6.1×10⁵／g，即已形成侵入性感染。本实验的结果表明感染组平均痂下菌量为3．4×10⁶／g，已形成侵入性感染；而IgY预防组则得到有效的保护，未形成侵入性感染。

　　2.烧伤48h后血液和脏器细菌学培养：经血液和肝、脾、肾脏器细菌学培养，结果均未检出白念珠菌。表明白念珠菌均未在各组鼠的全身形成侵入性感染。
　　3.脏器的大体解剖与病理切片检查：
　　(1) 大体解剖结果：伤后各组鼠肝、脾、肾均无明显异常。烧伤组痂下组织除轻度水肿外，尚有4只鼠创面痂下有明显豆腐渣样坏死物质及脓性分泌物，IgY组及对照组痂下组织均未见明显异常。
　　(2) 病理切片结果：伤后48h各组大鼠肝、脾、肾均未见明显病理改变，仅感染组大鼠肾小球有轻度炎症水肿。

讨　　论

烧伤病人免疫功能明显低下，极易继发感染白念珠菌。随着白念珠菌感染率的不断升高，近十几年来，国内外学者已应用分子生物学技术对其感染、毒素、抗体、疫苗和诊断方面进行许多深入的研究。Costantino (1994)^［5］的研究发现，高浓度的抗体活性与小鼠体内的白念珠菌病的消退有关。Matthews^［6～8］则从临床上慢性皮肤粘膜念珠菌病、系统性念珠菌感染、AIDS、原发性免疫功能缺陷状态及动物实验结果综合分析，发现针对白念珠菌胞浆47Kd蛋白抗原的抗体与机体系统性白念珠菌感染的恢复有关，病情好转或痊愈的病人，血中均检出高效价的47Kd抗原抗体，而感染持续发展或死亡病人血中，往往检不出该抗体。因此认为，该抗体对系统性白念珠菌的感染具有保护性作用，这提示体液免疫在白念珠菌感染中可起重要作用。基于这一新的思路，本课题组研制出抗白念珠菌特异性IgY，应用于烧伤鼠预防继发白念珠菌感染，结果表明，应用IgY烧伤鼠痂下仅检出2例有极少量的白念珠菌，且未形成痂下感染。而这少量白念珠菌有可能是人工感染存留在痂皮上的。与此对照的感染组则80%形成痂下侵入性白念珠菌感染，此外，经细菌学检查鉴定，还有40%并发化脓性葡萄球菌感染。这一结果表明，白念珠菌感染将进一步导致机体免疫功能下降，加重并发感染。本实验应用抗白念珠菌特异性IgY，对提高大鼠免疫功能，特异性预防白念珠菌感染具有明显的作用。且此IgY目前国内外尚未见报道。
　　IgY是近年来免疫应用学方面的一大研究热点，由于IgY具有众多的优越特性，因此倍受免疫学者的关注。IgY不仅来源丰富、产量高，在相同的免疫时间内由一只鸡所产生的鸡蛋中提取的抗体远比一只兔血清制备的抗体多^［9］。而且抗体的均一性上类似单克隆抗体。此外，对热及酸碱稳定性好，4℃保存5年或室温放置6个月抗体活性仍无明显下降，在pH4．0～11．0时稳定^{［10～12］}。由于鸡与哺乳动物，特别是与人类亲缘远，尤其在IgY的抗原性上与人相差甚远，所以IgY在人体内不与抗人IgG抗体发生血清反应^［13］；并且，鸡的致病原通常对人类无致病作用，因此鸡源性抗体(包括血清和卵黄中的抗体)在人类疾病的诊断、预防、治疗上有较大的价值。
　　大多烧伤患者由于其免疫功能下降，易继发白念珠菌及其它细菌感染，此感染一旦发生，病死率极高。为此，早期进行预防实属必要。本研究制备的抗白念珠菌特异性IgY的应用，将有助于烧伤患者继发白念珠菌感染的预防。

参考文献：