丹参及β－七叶皂甙钠减轻烫伤大鼠氧自由基损害的实验研究

【摘要】目的：探讨丹参及β-七叶皂甙钠减轻大鼠烫伤后氧自由基损害的治疗作用及其机制，为临床治疗烧伤后急性肾损伤(Acute Renal Injury，ARI)提供理论依据。方法：制作30%TBSA Ⅲ度大鼠烫伤模型，并随机分为盐水组(M)、丹参组(S)、β-七叶皂甙钠组(A)及联合组（C，丹参＋β-七叶皂甙钠），另设假烫对照组(N)，每组8 只。烫伤后24h取外周血测白细胞粘附聚集(LAA)，取肾组织测丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)及肾组织含水量(WCT)。结果：丹参组、β-七叶皂甙钠组及联合组外周血LAA、肾组织MDA及WCT明显低于盐水组，联合组最低；SOD含量明显高于盐水组，联合组最高。结论：丹参及β-七叶皂甙钠通过减轻中性粒细胞(PMN)在肾内的聚集、粘附，减少肾组织内氧自由基的含量，提高抗氧化剂SOD的水平及减少肾含水量等机制，对烧伤后ARI有一定防治作用，联合应用效果更佳。

【关键词】烧伤；肾损伤；丹参；β-七叶皂甙钠；丙二醛；超氧化物歧化酶

【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2009.01.003

Experiment Study of Mitigating the Injury Caused by Oxygen free Radicals with Salviae Miltrorrhizae and β-aescinom Natricum in Burn Injury of Rats．HOU Jian¹, JIANG Miao-na², JIA Yu-jie².　1. Department of Burns and Plastic Surgery, The 4^th Peoples′Hospital, Dalian City, Liaoning Province, 116031, China; 2. Pathophysiology Department, Dalian Medical University, Dalian City, Liaoning Province, 116044, China

【【Abstract】Objective: To explore the treating effect and mechanism of mitigating injury caused by oxygen free radicals with salviae miltrorrhizae and β-aescinom natricum in the burn injury of rats so as to provide a theoretical basis for clinical treatment of acute renal injury of burns injury. Method: Forty rats were randomly divided into sham scalding control group(N, n=8), sodium chloride group(M, n=8), salviae miltrorrhizae group(S, n=8), β-aescinom natricum group(A, n=8), and combination group, i.e. salviae miltrorrhizae andβ-aescinom natricum (C, n=8). The rats in M, S, A and C groups were subjected to 30% TBSA of Ⅲ degree scald on the back, and all the rats were sacrificed at 24 PBH. The blood and kidney samples were collected from the rats at 24 PBH for the determination of leukocyte adhesiveness/aggregation(LAA) in peripheral blood and malondialdehyde(MDA) and superoxide dismutase(SOD) contents, and the ratio of wet to dry weights(WCT) of kidney tissue.　Result: Compared with those in M group, the LAA in blood and the kidney tissue contents of MDA and WCT in S and A groups, and especially in C group, were decreased significantly, but the SOD content in kidney tissue increased obviously in S and A groups, the highest observed in C group. Conclusion: Postburn intra-kidney agglutination and aggregation of PMN and kidney injury caused by oxygen free radicals (OFRs) could be inhibited by either Salviae Miltrorrhizae or β-aescinom natricum. In addition, these agents could also increase the tissue content of antioxidant and decrease renal water content. The results indicated that all the agents used might be effective in prevention and treatment of postburn renal injury, especially when used together.

【Key words】Burn; renal injury; Salviae miltrorrhizae; β-aescinom natricum; Malondialdehyde; Superoxide dismutase

严重烧伤所致的急性肾损伤（Acute Renal Injury，ARI)是烧伤后常见的脏器损害之一^[1]，临床上轻者表现为急性肾功能不全，重者表现为急性肾功能衰竭，其病理生理改变主要是肾血流动力学异常及组织细胞代谢障碍等，是严重烧伤的主要死亡原因之一^[2]。一些研究表明，烧伤后肾毛细血管床有大量中性粒细胞(PMN)滞留并粘附在微血管壁上，被激活的PMN释放大量氧自由基，导致细胞膜脂质过氧化、细胞膜功能破坏及能量代谢障碍，使血管通透性增高，肾净含水量增高，引起肾水肿，为烧伤后ARI的重要发病机制^[3]。本实验选用中药丹参及西药β-七叶皂甙钠两者联合治疗，观察大鼠30%体表面积(TBSA)Ⅲ度烫伤24h后，外周血测白细胞粘附聚集(LAA)、肾组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及肾组织含水量(WCT)的变化，观察并分析丹参及β-七叶皂甙钠两者联合应用对减轻大鼠烫伤后氧自由基损害的防治作用及可能机制，为ARI的治疗提供新的实验依据。

1.材料与方法

1.1.材料与试剂：SD 大鼠40只，体重(225±25)g，雌雄不拘(大连医科大学实验动物中心提供)，丹参注射液由正大青春宝有限公司生产(批号0205213)，β-七叶皂甙钠由长青天诚药业有限公司生产(批号20020615)。SOD、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2.动物模型：32只大鼠用乙醚麻醉，背部脱毛，将其背部浸于100℃水中12s后，立即用冷水冲洗伤处，致30%TBSAⅢ度烫伤(病理切片证实)，伤后立即腹腔注射5%葡萄糖生理盐水注射液(40ml/ kg) 抗休克，创面外涂碘伏预防感染。8只大鼠麻醉后（假烫对照组），背部脱毛，浸于37℃水中12s。动物于20℃饲养，伤后各组动物禁食水，置于集尿器中收集尿量。

1.3,试验分组：40只SD 大鼠随机分为5组，每组8只。分别为假烫对照组(N)、盐水组(M)、丹参组(S)、β-七叶皂甙钠组(A)及联合组（C，丹参＋β-七叶皂甙钠）。假烫对照组大鼠伤后不予治疗，其余各组分别于伤后立即、4h、12h 舌下静脉注射等渗盐水0.33ml/200g、丹参84mg/200g、β-七叶皂甙钠0.33mg/200g。

1.4.观察指标及方法：（1）LAA 试验[4]：各组大鼠于烫伤后24h 取内眦血，用38g/ L 柠檬酸钠抗凝，血与柠檬酸钠体积比为3∶1。将血滴于载玻片上，置于45℃温箱 2s～3s，使血液自然流下、风干，放入-20℃冰箱 10min，甲醇固定，苏木素染色。记数300个细胞中聚集白细胞所占百分比 (3个以上细胞间距离小于1个细胞的直径视为聚集)。（2）肾组织MDA、SOD含量的测定：取左肾组织，用分散器进行匀浆后，取上清液，采用比色法，严格按照试剂盒说明书进行检测。（3）肾组织湿、干重量比的测量：大鼠活杀后取右肾，立即称得湿重(W)；称后在80℃恒温下持续烤24h，再称得干重(D)，计算出肾组织含水量(WCT)=湿重－干重/湿重。（4）病理形态学观察：大鼠处死后立即开腹取右肾组织，迅速置于体积分数为10%甲醛溶液中固定，乙醇脱水，低温石蜡包埋、切片(厚4μm)、HE染色，光镜观察结果。

1.5.统计学处理：所有数据均以x±s表示，用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析及多元相关分析。

2.结果

2.1．结果：（1）烫伤后各组大鼠 LAA增高，盐水组增高最明显，与治疗各组比较差异有非常显著性意义（P＜0.01），丹参组与联合组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。（2）盐水组肾组织的MDA明显高于假烫对照组，两者相比差异显著（P＜0.01）。联合组MDA降低接近对照组水平（P＞0.05），β-七叶皂甙钠组高于联合组（P＜0.05）。（3）盐水组与假烫对照组比较，大鼠肾组织SOD明显降低（P＜0.01）；与丹参组、联合组比较差异有非常显著性意义（P＜0.01）；与β-七叶皂甙钠组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。β-七叶皂甙钠组与联合组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。（4）盐水组大鼠肾组织的含水量增高，与假烫对照组比较差异有非常显著性意义（P＜0.01）；与β-七叶皂甙钠组、联合组比较差异有非常显著性意义（P＜0.01），与丹参组比较差异有显著性意义（P＜0.05）。丹参组、β-七叶皂甙钠组与假烫对照组相比有显著性差异（P＜0.05），三个治疗组间相比，无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1　药物对外周血LAA、肾组织MDA、SOD含量及WCT的影响

Group	N	LAA(%)	MDA nmol/mg prot	SOD nmol/mg prot	WCT
N	8	8.9±6.0	0.720±0.111	15.03±1.78	0.737±0.091
M	8	28.0±8.0^**	1.834±0.087^**	7.74±1.53^**	0.821±0.017^**
S	8	20.1±5.13^△△※	0.983±0.049^△	11.60±1.06^*^△△	0.773±0.011^*^△
A	8	18.22±7.03^△△	1.300±0.073^*^△※	9.15±0.83^*^△	0.780±0.091^*^△
C	8	15.44±4.39^△△	0.824±0.145^△△	13.04±1.00^△△★	0.751±0.012^△△

*：与N组比较 p＜0.05　　**：与N组比较　 p＜0.01

△：与M组比较 p＜0.05　　△△：与M组比较　p＜0.01

※：与C组比较 p＜0.05　　★：与A组比较　 p＜0.05

2.2．肾组织病理形态变化：（1）肉眼观察：假烫组大鼠肾脏呈浅红色，质地柔软，富有弹性。盐水组大鼠肾脏色暗红，体积多肿大，重量增加，切面可见肾皮质有增厚，颜色发白，缺乏光泽；肾髓质充血，呈暗红色，皮髓质分界清楚。三个治疗组肾脏表面颜色较盐水组浅，肿大较轻，肾髓质充血不明显。（2）光镜观察：假烫对照组大鼠肾小球结构清晰，肾小球毛细血管内皮细胞排列紧密，肾小管上皮细胞无变性及坏死，肾小管管腔无缩窄，管腔内无渗出物（见图1）。盐水组肾小球血管内皮细胞肿胀，管腔皱缩变窄。肾小球毛细血管丛缩小，血管襻呈分叶状，肾小球毛细血管内可见中性粒细胞滞留（见图2）。三个治疗组的上述组织学改变均较盐水组明显改善，肾小球血管内皮细胞肿胀减轻，中性粒细胞滞留减少（见图3~5）。

图1　假烫对照组大鼠肾组织　　　　　图2　盐水组大鼠肾小球毛细血管

HE×100　丛缩小，血管襻呈分叶状，肾

小球毛细血管内可见中性粒细

胞滞留HE×100

图3　丹参组治疗后大鼠肾组织图4　β-七叶皂甙钠组治疗后图5　丹参及β-七叶皂甙钠

损伤程度减轻HE×100 大鼠肾组织损伤程度减轻联合组治疗后大鼠肾

HE×100 组织损伤程度减轻

HE×100

3.讨　　论

3.1．由于肾小球毛细血管床面积大、血流缓慢及管腔狭窄迂回的特点，烧伤后肾毛细血管床有大量PMN滞留、浸润并粘附在微血管壁上，使肾血管管腔狭窄，肾血流量减少，导致肾缺血^[5]。烧伤后局部组织破坏及全身炎症反应使PMN处于激活状态，被激活的PMN释放大量氧自由基、弹性蛋白酶、血小板活化因子(PAF)、血栓素A2(TXA2)等炎症介质引起细胞膜脂质过氧化，破坏肾微血管内皮细胞和降解细胞间基质，使肾微血管通透性增高，诱发肾水肿^[6]。本实验显示烫伤后各组大鼠LAA均明显增高，表明烫伤后白细胞参与了机体的炎症反应。伤后各组肾组织的WCT明显增高，与假烫对照组比较明显升高（P＜0.01），证实了伤后肾组织含水量增加，存在肾水肿，且PMN增高程度与肾组织含水量的升高呈正相关。以上均提示烧伤后PMN活动活跃，成为导致肾损伤，引起肾水肿的主要因素之一。

3.2．近年来，大量文献证实氧自由基（OFR）的增多与烧伤后肾损伤密切相关^[7]。OFR氧化能力强，它可直接破坏细胞膜的结构和功能，引发蛋白质、酶、核酸的过氧化损伤而导致脂质过氧化反应，降低细胞能量及三磷酸腺苷的含量，导致肾小球血管内皮细胞和肾小管上皮细胞的损伤，使毛细血管通透性增加，细胞外液移到细胞内，引起肾水肿而形成肾损伤^[8]。OFR通常不能直接被检测，但可通过检测体内或组织中的脂质过氧化反应的副产物（丙二醛，MDA）来间接反映体内OFR的水平。内源性抗氧化剂和抗氧化酶是调节氧化反应组织损伤程度的关键因素，通过抗氧化而对肾组织起到保护作用。抗氧化酶如SOD可通过还原反应，促使H₂O₂生成无损伤的水，降低OFR的含量，从而保护细胞膜，防止其发生氧化损伤。本实验结果显示，盐水组肾组织中MDA含量均明显高于假烫对照组，而SOD含量明显低于假烫对照组，提示烧伤后肾组织内确实存在脂质过氧化损伤，这与既往报道吻合^[9]。

3.3．丹参为中国药典收载的常见中药，其有效成分为丹参酮甲、乙，具有较为广泛的药理作用，如抗菌活性、抗炎、抗免疫作用^[10]。β-七叶皂甙钠提取于婆罗子的成熟果实，研究证实其有显著的抗炎、抗渗出及清除OFR的功能^[11]。本实验表明，应用了丹参或β-七叶皂甙钠后，LAA、MDA、WCT均有显著降低，以联合组降低最明显；SOD 明显升高，丹参组优于β-七叶皂甙组，以联合组升高最明显。实验结果显示丹参及β-七叶皂甙钠二者具有明显的抗氧自由基损伤作用，可减轻肾脏的过度炎症反应，恢复毛细血管通透性，改善微循环，减少肾组织含水量，对烧伤后ARI均具有明显的治疗作用，二药联合治疗效果更优。其治疗机制可能与有效抑制脂质过氧化损害并清除氧自由基、升高抗氧化酶 SOD 以提高烫伤后肾脏抗氧化应激能力以及显著抗渗出、抑制肾水肿发生有关。

参　考　文　献

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（收稿日期：2008-11-08）

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