目录

杨洪涛¹，梁剑虹¹，齐杰¹，李红霞¹，严笠²，曹蕊²，刘艳杰¹，李雯¹，吕炳鑫¹

1.河北医科大学石油临床医学院整形外科，河北 廊坊 065000

2.中国医学科学院整形医院瘢痕中心，北京 100041

【摘要】 目的：研究钙离子拮抗剂维拉帕米及尼卡地平对体外培养的瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响，同时对两种药物疗效进行比较，讨论两种药物的作用特点。方法：向对数生长期的增生性瘢痕成纤维细胞及瘢痕疙瘩成纤维细胞中加入不同浓度的两种药液，培养48小时后进行羟脯氨酸比色试验，并将OD值依公式换算成羟脯氨酸含量，进行统计学比较。结果：维拉帕米及尼卡地平组随着用药浓度的提高，细胞形态变化越来越明显，两种成纤维细胞显示出类似的形态学特点；与对照组比较，两药均可以降低培养上清液中羟脯氨酸的含量，且随用药浓度增加，羟脯氨酸含量进一步下降，高（100μmol/L）低（10μmol/L）浓度组均有显著性差异（p<0.05），同时两药作用特点也有所不同。结论：维拉帕米和尼卡地平均可降低增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的胶原含量，抑制胶原合成，对于增生性瘢痕，尼卡地平抑制作用略强于维拉帕米，而对于瘢痕疙瘩，则维拉帕米的抑制作用略强于尼卡地平。

【关键词】维拉帕米；尼卡地平；瘢痕；成纤维细胞；胶原

【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2009.01.005

The Effect of Verapamil and Nicardipine on Fibroblast Collagen Synthesis of Scar. YANG Hong-tao1, LIANG Jian-hong1, QI Jie1, et al. 1. Dept. of Burns and Plastic Surgery, the Affliicated Clinical Medical College of Petroleum, Heibei Medical University,Langfang City, Hebei Province, 065000, China；2.Scar Treaxment Center, Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Science, Beijing City, 100041, China

【Abstract】 Objective: To study the effect of verapamil and nicardipine on fibroblast collagen synthesis in vitro culture, to compare with the tratment effects and to discuss the the characteristics of role of the two drugs. Method: Adding dividedly the solution of two drugs  with different concentration into the heperplastic scar fibroblasts and keloid fibroblast which  were in logarithmic growth phase. After 48 hours in vitro culture, hydroxyproline colorimetric test was conducted, then statistics comparison was carried out in accordance with hydroxyproline content which was calculated based on OD value. Result: Following the increasing of concentration of verapamil and nicardipine, the cell shape changed obviously. Both two drugs can reduce the contents of hydroxyproline in the supernatant of cultured hypertrophic scar fibroblast (HSFB) and keloid fibroblast (KDFB). The hydroxyproline content in the high concentration group （100umol/l）and the low concentration group （10umol/l） showed significant difference(p<0.05). Conclusion: Verapamil and nicardipine can reduce the concent of collagen of HSFB and KDFB and inhibit collagen synthesis simultaneously. For hypertrophic scars, nicardipine inhibition was slightly stronger than verapamil, while, for the keloid, the inhibitory effect of verapamil slightly stronger than nicardipine.

【Key words】: Verapamil; Nicardipine; Scar; Fibroblasts；Collagen

在整形外科领域，病理性瘢痕仍是尚待解决的难题，因其形成机制尚未完全阐明，给临床治疗带来很大困难，除手术切除外，多种药物也试用于瘢痕治疗，包括皮质激素类^［1~2］、维甲酸^［3］、干扰素^［4］及中药的丹参^［5~6］、川芎嗪^［5，7］等，但疗效均不甚理想。寻找安全而有效的临床用药仍是当前研究的热点。自1992年Lee^［8］首先报道维拉帕米局部注射治疗烧伤后瘢痕以来，国内外相关报道不断增多，但大多集中在维拉帕米单一品种上，至于钙离子拮抗剂的其他药物如尼卡地平的抗瘢痕作用报道很少，就此我们对上述两种药物做了对比研究。

1.材料与方法

1.1.材料

1.1.1.药品：盐酸维拉帕米（verapamil）注射液(5mg/支)，上海禾丰制药有限公司生产，盐酸尼卡地平（nicardipine）注射液（5mg/支），浙江仙琚制药股份有限公司生产。

1.1.2.试剂：DMEM高糖培养基（Hyclome公司产品）胎牛血清（Gibco公司产品）；羟脯氨酸测试盒（北京天来生物医学科技有限公司产品）。

1.1.3.细胞株：增生性瘢痕成纤维细胞株（HSFB）7株，瘢痕疙瘩成纤维细胞株（KDFB）7株，均由中国医学科学院整形医院瘢痕中心馈赠。

1.1.4.仪器：Wtrspec 3300pro 紫外/可见光分光光度计；BINDER CB 150 CO2培养箱；Biotrak酶标检测仪；OLYMPUS ZX71 倒置显微镜；SORVALL SUPER 21高速冷冻离心机；SW-CJ-IF型超净工作台（苏净集团安泰公司）。

1.2.实验方法

1.2.1.药品配制：按国内王臻等法^［9］，将维拉帕米及尼卡地平按需要配制成高、中、低剂量组（100μmol/l，50μmol/l，10μmol/l），对照组为不加药组。将对数生长期的HSFB及KDFB分别接种于96孔板中，细胞悬液浓度为2.5×104/ml，每孔200μl，加入不同浓度试验药液，不加药组为对照组。每一浓度设5个平行孔，在37℃，5% CO2中分别培养48小时后，取培养上清液150μl于10ml离心管中，加水解液150μl，轻轻盖上，95℃水浴20分钟，流水冷却，加指示剂1滴摇匀，分别加入调PH甲、乙液致颜色为橙黄色（PH6.0~6.8），然后加蒸馏水至1.5ml，混匀，再加入10mg活性炭，3500rpm/分离心10分钟，取200μl上清液于1.5ml印管中，依次加入100μl试剂1，试剂2，试剂3，混匀后60℃水浴15分钟，冷却后3500rpm/分离心10分钟，于Wtrospec3300pro紫外/可见光分光光度计上检测吸光度（OD值）(570nm)，并根据公式计算羟脯氨酸含量：

羟脯氨酸含量（ug/ml）=（测定管吸光度－空白管吸光度） / （标准管吸光度－空白管吸光度）×标准管含量×(水解液总体积/取样量)

1.2.2.统计学处理：统计数据用（x(-)±s）表示，用统计软件spss10.0进行单因素方差分析。

2.结果

2.1.维拉帕米及尼卡地平对瘢痕成纤维细胞形态学的影响

对照组：细胞生长基本旺盛，密集，形态规则，以梭形细胞为主，中央有圆形核（见图1、图2）；而维拉帕米及尼卡地平组随着用药浓度的提高，细胞形态变化越来越明显，形态不规则，可见大量圆形，椭圆形细胞，细胞间隙增大(见图3、图4)；加入MTT液后，形态学变化显示的更明显(见图5、图6)；但两种细胞并未显示出明显不同。

图1. 加药前增生性瘢痕成纤维　    图2. 加药前瘢痕疙瘩成纤维细胞      图3. 加入维拉帕米（50μmol/L）

细胞（100×）                     （200×）                           后的增生性瘢痕成纤维细胞

（200×，72小时）

图4.　加入尼卡地平（50μmol/L）　图5.　加入维拉帕米（50μmol/L）    图6. 加入尼卡地平（50μmol/L）

后的瘢痕疙瘩成纤维细胞            后的增生性瘢痕成纤维细胞         后的瘢痕疙瘩成纤维细胞

（100×，72小时）                 （100×，72小时，MTT染色）     （100×，72小时，MTT染色）

2.2.维拉帕米及尼卡地平对增生性瘢痕、瘢痕疙瘩胶原合成的影响

与对照组比较，两药均可以降低HSFB、KDFB培养上清液中羟脯氨酸的含量，且随用药浓度增加，羟脯氨酸含量进一步下降，高（100μmol/L）低（10μmol/L）浓度组有显著性差异（P<0.05）；维拉帕米与尼卡地平高浓度比较，维拉帕米对KDFB作用强于尼卡地平（P<0.05），尼卡地平对HSFB作用强于维拉帕米(P<0.05)；而HSFB与KDFB比较，尼卡地平对HSFB作用强于KDFB(P<0.05)；而维拉帕米对HSFB，KDFB作用则无显著性差异（P>0.05）。见表1。

表1　两药对瘢痕成纤维细胞胶原合成的影响比较(x(－)±S，n=7)

注：与10umol/L浓度比较^*P＜0.05 ，与瘢痕疙瘩比较，^△P<0.05

3.讨　　论

目前已知，钙离子在伤口愈合过程中扮演着重要角色，在细胞水平，它可以作为细胞内信使，促进成纤维细胞增殖分化，使创伤得到愈合。但如果增殖分化过度，产生大量胶原为主的细胞间充质，便可形成所不希望的病理性瘢痕。1992年，Lee等最先报道了局部注射钙离子拮抗剂维拉帕米治疗烧伤后瘢痕，取得较满意疗效。本试验结果可以看到：在倒置显微镜下观察，无论是低浓度组（10μmol/L）还是高浓度组（100μmol/L） ，镜下成纤维细胞均有明显的形态学改变，由原来规则的梭形细胞变为圆形、椭圆形，细胞间隙增大。与国外报道一致^［10］。研究表明，凡是能使成纤维细胞形状趋于变成球形的因素，大多可导致胶原酶合成的增加，增加胶原的降解^［11］。我们应用羟脯氨酸法测量两药干预后的胶原蛋白的含量，结果显示无论是HS还是KD，随着用药浓度的增加，其胶原蛋白的含量明显下降。特别是高（100μmol/L）低（10μmol/L）浓度组出现明显的差异（P<0.05）。

羟脯胺酸在胶原蛋白中占13.4%，在弹性蛋白中占极少量，而其他蛋白中均不存在。创伤会导致羟脯氨酸排泄量增加。通过测定培养上清液羟脯氨酸含量，可间接反应瘢痕组织胶原的合成情况。本实验维拉帕米及尼卡地平虽然均显示可降低羟脯氨酸含量，但尼卡地平对增生性瘢痕作用要强于瘢痕疙瘩（^P<0.05），可能与较前报道的增生性瘢痕成纤维细胞内Ca²⁺浓度高于瘢痕疙瘩有关。但维拉帕米未能显示与之类似的结果，其原因有待进一步研究。有学者认为钙离子拮抗剂可抑制胶原的合成^［12］，而也有人认为其作用来源于胶原酶的增加，胶原的降解增强^［13］。还有的人认为两者兼而有之^［14］，其确切机制也有待进一步研究。

维拉帕米及尼卡地平在临床应用时，可引起低血压、体液潴留、浮肿、心律（率）改变、面色潮红、头痛及疲劳等副作用^［15~16］，其正常的血浆有效浓度为维拉帕米79.5nmol/L±48.6nmol/L，  尼卡地平43.2nmol/L±3.2nmol/L^［16］，而两者对瘢痕成纤维细胞的半数有效抑制浓度为10-5M左右，可见，其抑制浓度是平时应用的血浆有效浓度100~1000倍。故我们只能寻求局部注射或体表用药的途径来治疗瘢痕。自Lee等最早将维拉帕米应用于临床后，D.AndreaF^［17］，Copeu^［18］，陈力扬^［19］等均应用局部注射维拉帕米治疗增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，用药浓度为2mg~10mg/次不等，多为2.5mg/L浓度，疗程也不等，均报道有可靠的疗效，且未发现严重的不良反应；而京萨^［20］等尝试应用自制维拉帕米霜外涂于兔耳增生性瘢痕表面，也取得了满意疗效，未发生不良反应。由此可见，局部应用维拉帕米治疗瘢痕是安全可靠的，但尼卡地平是否也有同样的效果，临床尚无相关报道，有待进一步研究。如何选择最佳的钙离子拮抗剂种类，最佳有效治疗剂量及给药途径来治疗瘢痕，均是我们今后研究的方向。

4.结　　论

维拉帕米和尼卡地平均可降低增生性瘢痕及瘢痕疙瘩的胶原含量，抑制胶原合成。特别是在高浓度时（100μmol/L)，对于增生性瘢痕，尼卡地平抑制作用强于维拉帕米，而对于瘢痕疙瘩，则维拉帕米的抑制作用强于尼卡地平。同时尼卡地平对增生性瘢痕胶原合成抑制作用也强于其对瘢痕疙瘩的作用，但对于两种瘢痕，维拉帕米未显示出类似结果。

钙离子拮抗剂通过抑制成纤维细胞胶原合成或促进胶原降解，发挥抑制瘢痕的作用，值得临床进一步研究和推广。

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【作者简介】

杨洪涛（1971~），男（汉族），河北廊坊市人，1994年毕业于河北医科大学，外科学硕士，副主任医师.

梁剑虹（1958~），男（汉族），天津市人，1983年毕业于河北医科大学，外科学硕士，教授，硕士生导师，副院长.

齐杰（1969~）男（汉族），河北辛集市人，1993年毕业于白求恩医科大学，医学硕士，副主任医师，科主任.

（收稿日期：2008-06-17）