目录

廖毅  王太平  童庭辉
作者单位：646000四川泸州，泸州医学院附属医院整形烧伤科

【摘要】目的 探讨局部应用水蛭素对静脉淤血皮瓣成活的影响及其作用机制。方法 将18只健康大耳白兔随机分为3组：1个对照组（A组：注射生理盐水组）和2个治疗组（B组：低分子肝素治疗组；C组：重组水蛭素治疗组），每组6只。在左耳背部设计3 cm×6 cm的含耳中央血管、神经为蒂（蒂宽1 cm）的轴型皮瓣，于蒂部结扎并切断耳中央静脉和神经，并结扎其他旁支静脉，创面用5-0丝线结扎止血，制成以耳中央动脉为唯一血供，1 cm宽的蒂部为唯一静脉回流途径的静脉淤血皮瓣模型。治疗组在术后立即分别给予皮瓣下多点、均匀注射水蛭素（1 U／1 ml/皮瓣）或低分子肝素（0.5 mg/1 ml/皮瓣），对照组同法给予等量（1 ml）生理盐水，皮瓣用5-0丝线原位缝合。术后观察皮瓣表面毛发脱落、血肿形成情况和皮瓣存活率，利用组织学观察毛细血管血栓形成情况以及中性粒细胞附壁及红细胞聚集情况和免疫组化检测皮瓣内VEGF蛋白的含量。结果 ①肉眼观察：皮瓣形成后所有皮瓣均肿胀明显，远端淤血形成，颜色暗红，对照组颜色明显深于治疗组，水蛭素治疗组1例（1/6），肝素治疗组2例（2/6），生理盐水对照组4例（4/6）出现明显的血肿。②各组皮瓣存活率：低分子肝素及重组水蛭素治疗组成活面积百分比分别为（92.33±1.67）%与（94.83±1.91）%，均比生理盐水对照组的（77.93±1.18）%高，有显著差异（P＜0.01），重组水蛭素治疗组与低分子肝素治疗组的皮瓣存活率无显著统计学差异（P>0.05）。③组织学及免疫组化：治疗组皮下毛细血管内血栓形成及红细胞聚集情况均比对照组轻，重组水蛭素治疗组皮瓣中VEGF表达较其他两组增多。结论 重组水蛭素的应用可明显改善皮瓣的静脉淤血，促进皮瓣血管生成，提高皮瓣的成活率，并可避免发生肝素应用过程中的血小板减少症等严重并发症，可代替肝素在临床上的应用。
【关键词】重组水蛭素；低分子肝素；皮瓣；静脉淤血
【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2011.02.011
【文章类型】论著

【Abstract】Objective To evaluate the effect and mechanism of topical application of hirudin on the survival of flap with passive congestion. Methods 18 healthy big ear white rabbits were randomly divided into 3 groups, a control group (Group A: saline injection group) and two treatment groups (Group B: low-molecular-weight heparin injection group, Group C: recombinant hirudin injection group), 6 rabbits each group. An axial flap based on ears central blood vessels and nerves (base width 1cm) was designed in size of 3×6cm on the back of the left ear with the ligation and cutting off of ears central vein and nerves, other branch veins were also ligated, the wound was sutured with 5-0 silk to stop bleeding, thus the model of flap with passive congestion was set up to be with the only blood supply of ear central artery and the only venous return of the 1cm-wide base. The flaps in treatment groups were given immediately after operation subcutaneous injection of multipoint well-distributed hirudin (1U/1ml/flap) or low-molecular-weight heparin (0.5mg/1ml/flap) respectively, equivalent amount of saline(1 ml) was given to the control group in the same way, and the wound was the sutured with 5-0 silk in situ. The status of hair loss and hematoma on the flap and the survival rate of the flap were observed postoperatively. Histological observation of the capillary thrombosis, the wall attachment of neutrophil and the erythrocyte aggregation and immunohistochemical analysis of content of VEGF protein in flap were also conducted. Results (1) Visual observation: All flap appeared significant swell with congestion at the far end in the color of dark red.  The colors of the flaps in the control group were significantly more heavy than that of the treatment groups. Obvious hematoma appeared in different number of cases in hirudin injection group (1/6), heparin injection group (2/6) and saline control group (4/6). (2) The survival rate of flaps: the survival area of low-molecular-weight heparin injection group and recombinant hirudin injection group were 92.33±1.67% and 94.83±1.91 respectively，both higher than that of saline control group (77.93±1.18%) with significant difference (P<0.01 ). There was no significant difference between the two treatment groups（P>0.05）. (3) Histology and immunohistochemistry: The thrombi forming in subcutaneous capillaries and the erythrocyte aggregation in treatment groups were less than that in control group. Expression of VEGF in recombinant hirudin injection group was more than the other groups. Conclusion Application of the recombinant hirudin can significantly alleviate the venous passive congestion in the flaps, promote angiogenesis, and improve the survival rate of the flap. In addition, it can avoid severe complications like thrombocytopenia happened in the application of heparin. The recombinant hirudin can be used clinically instead of heparin.
【Key words】Recombinant hirudin; Low molecular weight heparin; Flap; Venous congestion

皮瓣坏死是外科手术后常见的并发症，统计表明，皮瓣移植术后静脉危象的发生率比动脉危象高得多[1~2]，皮瓣的完全或部分去交感效应使血管的痉挛性明显降低，对扩血管药物的反应差，因此,抗凝治疗防治皮瓣静脉淤血进而改善皮瓣的存活成为大家研究的热点。其中，具有抗凝、抗血栓形成作用的低分子肝素在临床上广为应用，但肝素治疗过程中偶可发生血小板减少症，也是肝素治疗过程中最严重的不良反应。与肝素作用相似并对肝素诱导的血小板减少症有治疗作用的水蛭素日益受到人们的重视。
本实验通过建立兔耳静脉淤血皮瓣模型，探讨局部应用重组水蛭素对静脉淤血皮瓣成活的影响，观察比较局部注射低分子肝素和水蛭素对静脉皮瓣成活的保护作用。
1.材料与方法
1.1.主要实验试剂
重组水蛭素由广西科康水蛭素股份有限公司提供。低分子肝素由昆明积大制药有限公司提供。人抗兔VEGF多克隆抗体由成都精博生物技术有限公司提供。
1.2.实验动物和分组
健康普通大耳白兔18只，雌雄不拘，体重2200 g±200 g(泸州医学院实验动物科提供)，随机分为3组：1个对照组（A组：注射生理盐水组）和2个治疗组（B组：低分子肝素治疗组；C组：重组水蛭素治疗组），每组6只。分笼喂养，自由饮水，室温25℃±2℃。
1.3.实验方法
实验前晚停止喂饲，按0.2 mg／kg于右耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠麻醉，麻醉后侧卧位，固定四肢，消毒，铺无菌巾。在左耳背部设计3 cm×6 cm的以含耳中央血管、神经为蒂（蒂宽1 cm）的轴型皮瓣。在光学放大镜下，分离耳中央静脉和神经，并于蒂部切断并结扎，一并结扎其他旁支静脉，创面用5-0丝线结扎止血。制成以耳中央动脉为唯一血供，1 cm宽的蒂部为唯一静脉回流途径的静脉淤血皮瓣模型。治疗组在术后立即分别给予皮瓣下多点、均匀注射水蛭素（1 U／1 ml/皮瓣）或低分子肝素（0.5 mg/1 ml/皮瓣），对照组同法给予等量（1 ml）生理盐水，皮瓣用5-0丝线原位缝合。
1.4.检测指标
1.4.1.肉眼观察每日观察皮瓣颜色、质地、渗出、表面毛发脱落情况、血肿形成情况，观察至皮瓣远端淤血消散为止。
1.4.2.皮瓣存活率术后7 d，麻醉动物，美兰描画皮瓣范围及坏死部位，用硫酸纸临描，以不同颜色区分坏死与成活区域，扫描后，利用计算机全自动图像分析系统求出皮瓣成活面积与总面积之比(皮瓣成活面积的百分率=皮瓣成活面积／皮瓣面积×100%)，即皮瓣存活率。按皮瓣存活的百分率进行统计分析。
1.4.3.组织形态学观察术后第1 d、3 d、5 d、7 d于皮瓣中点处切取5 mm×5 mm全层皮肤组织，用10%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜下观察毛细血管血栓形成情况、红细胞聚集情况和中性粒细胞附壁情况。
1.4.4.皮瓣VEGF的表达测定分别选取术后第3 d、5 d、7 d的病理组织切片，采用免疫组化SP方法检测VEGF，具体操作简述如下：用10%福尔马林固定48 h后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。做5 μm垂直切片，切片经脱蜡等一系列处理后，消除内源性过氧化物酶的活性，加兔IgG多抗VEGF抗体和羊抗兔抗体，滴加SP试剂，待反应充分后，二氨基联苯胺(DAB)显色,苏木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明后封片，光镜下观察。
1.5.统计学方法
所得数据为计量资料，以均数±标准差（x(_)±s）表示。应用SPSS 14.0统计软件，对数据进行单因素的方差分析。规定P＜0.05时，差异有统计学意义。
2.结果
2.1.肉眼观察
术中观察发现，皮瓣形成后所有皮瓣创面渗血及肿胀明显，远端淤血形成，颜色暗红，术后第1 d观察发现对照组颜色明显深于治疗组，治疗组A、B组间无明显区别；术后第3 d治疗组皮瓣肿胀明显比对照组轻。血肿形成情况：术后第1 d，水蛭素治疗组1例（1/6）,肝素治疗组2例（2/6）,生理盐水组4例（4/6）出现明显的血肿。毛发脱落情况：在皮瓣完全坏死区域毛发脱落明显，其余部位未见明显毛发脱落。皮瓣成活面积：治疗组坏死面积均比生理盐水组小，重组水蛭素组坏死面积最小，位于皮瓣远端边缘。所有皮瓣均无伤口感染、脓肿形成、伤口裂开。
2.2.皮瓣成活率
各组皮瓣成活面积见表1。

重组水蛭素与低分子肝素治疗组皮瓣存活率均较生理盐水组高，差异有显著统计学意义（P<0.01）。重组水蛭素治疗组皮瓣成活率与低分子肝素治疗组皮瓣存活率相当，差异无统计学意义（P=0.167>0.05）。
2.3.组织学观察
HE染色，光镜下观察。治疗组：术后第1 d、3 d，真皮内毛细血管及微静脉内可见少量红细胞聚集，皮下未见血栓形成；术后第5 d、7 d毛细血管及微静脉内红细胞聚集消散。生理盐水对照组：术后第1 d、3 d、5 d，真皮内毛细血管及微静脉内大量红细胞聚集，单核及中性粒细胞附壁，并可见红细胞变性，含铁血黄素释放，染成淡黄色，可见皮下微静脉内血栓；术后第7 d毛细血管及微静脉内红细胞聚集程度有所减轻。
2.4.皮瓣中VEGF的表达
C组皮瓣毛细血管内皮细胞胞质内可见棕褐色的VEGF抗原抗体复合物的沉积，部分沉积物呈带状围绕血管腔。A组、B组可见少量VEGF抗原抗体复合物的沉积，呈浅褐色。
3.讨论
水蛭素是迄今为止最强的直接凝血酶抑制剂[3]，特异性抑制凝血酶，能抑制凝血酶的蛋白酶解作用，不依赖抗凝血酶Ⅲ的存在；抑制凝血酶诱导的血小板释放和聚集；降解纤维蛋白的特定肽链，阻止血栓形成并融解已经形成的血栓，对多种高凝状态的疾病有良好的疗效，如：水蛭素明显抑制脑出血周围组织内凝血酶受体(PAR-1) 表达，同时使脑组织水肿和神经凋亡显著减轻[4]。水蛭素能够减弱动脉粥样硬化主动脉壁内皮素mRNA的高表达，减轻血管平滑肌细胞的增生，并通过抑制脂蛋白C，降低细胞毒性和减轻内皮损伤，起到保护内皮的作用[5]。目前，水蛭素已广泛应用于脑血栓和脑出血的治疗，在减轻脑出血水肿，血液透析过程中抗凝，治疗心肌梗死和不稳定型心绞痛，预防血管成形术后血管的再闭塞以及外科手术后的血栓形成，抑制增生性玻璃体视网膜病变等方面，均取得了良好的疗效，是国内外正在开发的新一代高效特异性抗凝、抗栓药物。
本实验结果显示，低分子肝素、重组水蛭素的局部应用，降低了皮瓣转移术后早期组织损伤和炎症反应，明显减轻了皮瓣内毛细血管和微静脉内血栓形成、红细胞聚集、中性粒细胞附壁，减轻了皮瓣组织中微血管的损伤，改善了皮瓣的静脉淤血。重组水蛭素的应用除了明显改善皮瓣的静脉淤血外，还促进了皮瓣血管的生成，提高了皮瓣成活率。因为重组水蛭素可避免肝素应用过程中的血小板减少症等严重并发症的发生，可代替肝素在临床上的应用。
参考文献
[1]顾玉东.皮瓣的静脉危象及其处理[J].中华手外科杂志,1996,12(3):131~133.
[2]Brown JS, Devine JC, Magennis P, et al.Factors that influence the outcome of salvage in free tissue transfer[J]. British Journal of 0ral and Maxillofacial Surgery,2003,41(1):16~20.
[3]李超，张相年，石磊.水蛭素及其临床应用[J].实用医学杂志,2007,23(21):3458~3459.
[4]姜亚军，常诚，张琳，等.脑出血后脑组织内凝血酶受体-1(PAR-1)的表达及其病理意义[J].中风与神经疾病杂志,2004,21 (2):100~103.
[5]李风文，刘晓颖，张力石，等.水蛭及其复方对实验性动脉粥样硬化家兔主动脉内皮素基因表达的影响[J] .中医杂志,1999,40:50~51.

（收稿日期：2010-08-02）