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IN VITRO HUMAN EPIDERMAL CELL CULTURE

郭文平 冯德华 李牧尧

赵荣枝 韩秀英

（内容摘要）我院从1990年5月起开展了人表皮细胞的体外培养，在培养过程中对四种培养方法作了比较，根据我院条件饲养层法最适宜。同时对使用CO2孵箱和普通温箱培养作了对照，结果是两种温箱培养表皮细胞长成膜片的时间无明显差别。

关键词：人表皮细胞体外培养饲养层

以少量的自体皮肤及时覆盖大面积创面已成为烧伤研究的重要课题，近年来，由于表皮细胞培养技术的发展，已能从小块皮肤经体外培养增殖成能够覆盖大面积III度创面的人表皮细胞膜片，以解决大面积深度烧伤病人自体皮源不足的问题。这项技术有着广阔的应用前景，受到国内外同行的普遍重视。我们参考了国内外的文献后，结合我院现有条件，对人表皮细胞的体外培养进行了探索，并培养成功，现报告如下：

材料

3个年龄组（幼年组、成人组和人胚）的健康人皮片；GH12A细胞系（自建）；培养液（含10％新生牦牛血清的RPMll640，每升RPMll640中含青霉素10万u，链霉素10万u，胰岛素20矿，氢化考的松400ug，表皮生长因子（EGF)10ug，pH6．8～7）；胰酶消化液，每升D—Hanks液中含胰酶堆， EDTA2Nal00mg。

方法

1．人表皮细胞的准备

将手术中剩余的皮片放人合双抗的D—Hanks液中（青霉素1000u／ml、链霉素 ling／ml），储放在4℃冰箱内，一般放置2小时左右。接种前先依次在三个装有含双抗的D—Hanks液的平皿中漂洗。如果是全厚皮要将皮下脂肪除去，然后将皮片剪成2cm2的小片放入胰酶消化液中，37℃消化30～60分钟（视皮片的厚薄而定，必要时还可二次消化）。将消化后的皮片的表皮层与真皮层分开。

2．接种：

以四种不同的方法接种

1）组织块法：将表皮层剪成lmm2大小的碎块，点种在25ml小方瓶的底面，排列密度要大。然后将瓶翻转，加入培养液（我们使用RPMll640，中含抗生素、胰岛素、氢化考的松，表皮生长因子）。培养瓶在37℃反置3个小时后再把瓶正过来，使组织浸在培养液中。在培养初期要避免移动，以防止组织块脱落。

2）细胞悬液直接培养法：将表皮皮片剪碎再放入原有的胰酶中，吹打分散，然后2000转／分离心20分钟，弃去上清液，加入培养液，吹打成表皮细胞悬液。悬液可作细胞计数，作为估计接种量的依据。细胞悬液被分装在小方瓶内，每25ml小方瓶的接种量不少于106。补足培养液使每瓶在4ml左右。

3）载体法：为使培养的细胞膜片提取方便，我们使用肾透析用的半透膜做为载体。半透膜事先固定在培养瓶内，然后按上述方法将表皮细胞悬液接种在半透膜上。

4）饲养层培养法：应用我室1985年建立的GH12A细胞[1]作为饲养层细胞。

①细胞的准备：GH12A细胞传代后4天，一般密度达105～106／瓶，这时换液，用Co6030000rad照射（或用丝裂霉素2ug处理24小时），再置37C继续培养24～48小时。

②表皮细胞接种：取上述GH12A细胞，弃去原培养液，加入表皮细胞悬液，接种密度同前。或将GH12A细胞消化后与表皮细胞混合接种。

3．培养

用四种方法接种的表皮细胞置普通恒温箱或5％CO2孵箱中37℃恒温培养，48小时后换液。 开始在倒置显微镜下观察，以后每隔2天换液一次。并记录生长情况。

结果

一、四种接种方式表皮细胞生长情况的比较：

1．组织块法：组织块不易贴壁。仅有30％左右，其余则漂浮，48小时后，组织块周围仅有少量表皮细胞游离出来。10天后，组织块边缘伸出一些小片。20天后小片有所增大，但组织块之间相距较远，小片扩增慢，很难汇成单层。

2．细胞悬液直接培养法：48小时后，镜下可见密集的单个细胞，但多数随培养液晃动，第一次换液后细胞密度就减少一半。待全部悬浮细胞随换液弃去后，剩下的贴壁细胞只占接种细胞的10～20O。10天后贴壁细胞呈集落生长，由单个细胞变为细胞簇。20天后，镜下见到一个个小的细胞膜片，一个月后仍未长满单层。

3．载体法：在此法中首先遇到的问题是半透膜在瓶内不易固定，常随培养液晃动飘起。以后改为先用少许小牛血清使半透膜贴于瓶底，再高压消毒培养瓶，使半透膜得以固定。然而表皮细胞在半透膜上的贴壁率依然较低，与玻璃表面相比，半透膜表面更光滑，贴壁长成的细胞膜片在换液和观察过程中随培养液晃动而脱落。镜下见小膜片边缘翻起，静置时又贴上，如此反复，影响细胞生长。

4．饲养层培养法：人表皮细胞接种在饲细胞上，24小时后表皮细胞贴在成纤维细胞形成的网架上，并沿其生长，很快进入对数生长期。细胞集落不断向四面扩展，与周围集落相连接。先是在网架上，然后伸向网眼。集落中心不断增厚，呈复层生长方式，镜下观察约有5至7层之厚，最后互相融合成一片。平均2周到3周长满瓶底。肉眼可见瓶底有一层白膜。

人表皮细胞与消化成细胞悬液的GH12A细胞混合接种者，表皮细胞与饲细胞共同贴壁，饲细胞经动Co60照射后再贴壁、生长能力不及从前，接种后密度不高，大量的表皮细胞挤在一起贴在密度不高的饲细胞上，呈集落状生长，长成较厚的复层。但向四周扩展较慢，助天后长成一个个的皮丘，肉眼可见到一个个白色颗粒，一个月后许多表皮细胞和饲细胞一起脱落。

二、来源于不同年龄组的表皮细胞生长情况比较：

来源于各年龄组（人胚、幼年、成人）的皮片都能在贴壁后很块生长，生长的优劣取决于接种方法和接种密度。用饲养层培养法时，与饲细胞的密度相关。因为它直接影响表皮细胞的贴壁率。一例来自5岁男孩的表皮接种在长成的饲细胞上，11天长满单层。这一速度超过了人胚皮及成人表皮。根据文献的报告，表皮细胞长满单层的时间与年龄组有关，但在具体情况下很难将其它影响因素控制到完全相同，而单纯就年龄组进行比较。

讨论

早在70年代中期，人表皮细胞培养方法就取得了较大的进展，特别是Freemann等（2）以猪皮为支持物改进了皮块培养法；Green等（3）在人角质细胞培养中提出了用3T3细胞或其它成纤维细胞作为饲养层的培养方法。并进行了人表皮细胞的培养。在他后来的报告中指出应用饲养层细胞的优越性：一是表皮细胞可以传代；二是饲细胞类似表皮细胞的基底细胞，有利于表皮细胞增殖，并可以保持分化状态；三是可以抑制与表皮细胞来源的成纤维细胞混杂生长； 四是表皮细胞的形态和结构不发生改变。应用Green的方法，麻省中心医院Gallico等[4] 1984年将培养的表皮细胞自体移植给2例大面积烧伤的儿童，取得了成功。到了80年代中期，又有许多表皮培养成功并用于临床的报告[5]。

国内第三军医大学最先开展了这方面的工作。赵雄飞等[6]采用了带有真皮层的组织块培养法。上海烧伤研究所的李映月[7]使用三种培养方法均获成功，并对比了各自的利弊。

在我们应用的四种培养方法中，前三种都不理想，唯饲养层方法满意，长成单层时间短。结合我们的实践体会，就以下两个方面进行讨论。

一、不加支持物的培养方法效果不佳的原因：

表皮细胞是分化程度较高的细胞，在体内与真皮及皮下组织形成依赖关系，从中获取营养生长刺激物。而在我们的培养方法中已将表皮与真皮分开，这就破坏了依从关系，在塑料和玻璃器皿表面很难贴附，影响了表皮细胞的生长。文献中报告的组织块法都没有把表皮、真皮分开，这可能是他们成功的原因。我们也曾用白鼠全皮培养获得成功，但成纤维细胞生长很难控制。为了避免这一麻烦，我们一开始就撕弃真皮层，文献中也有单独表皮培养成功的报导。那么，为什么我们的表皮细胞直接培养方法不能奏效呢？我们将自己的培养条件与上述作者报告的条件相比较，也有不少差别，例如使用的培养基不同，大多数作者采用的是MEM或DMEM培养液，增添了包括表皮生长因子（进口）和霍乱毒素等附加成份。这些培养液中钙离子的浓度较为合适。此外还有专为表皮培养而设计的MCDB153培养液，钙离子浓度为0．3mM。我们根据现有条件只用了RPMll640，可能也是表皮贴壁率低，生长慢的原因之一。

二、饲养层培养方法的评价：

Green对饲细胞培养方法所提的几条优点，在我们的实践中已得到证实。李映月也认为表皮细胞接种在3T3细胞滋养层上接种密度低，生长稳定，传代多至第六代。它的主要缺点是培养程序比较麻烦，饲细胞又是异种细胞，所产生的异种蛋白可能会在移植后产生不良反应[8]。就前一条来说，GH12A细胞是自建细胞，生长特性都较熟悉，培养起来并不麻烦；而后一条国外既然已有成功的报告，说明影响不会太大。

我们认为应用饲细胞作支持物的方法最大的优点是对培养基，培养器皿，培养环境的要求都不高。掌握的好，可以较快地长满单层，及时用于移植。更适于条件较差的地方。

对以上四种培养方法，在培养过程中，我们同时使用CO2孵箱和普通温箱，在其它条件相同 的情况下，使用CO2孵箱培养和使用普通恒温箱作培养对表皮细胞的生长没有多大影响。当然使用普通温箱作培养更经济，也便于普及。

表皮细胞培养技术还在不断更新。如Pittelkow等[9]将表皮细胞培养分两步进行，第一步用无血清培养基，使表皮细胞获得大量增殖；第二步加入血清刺激表皮细胞分化，使表皮细胞的质和量都达到要求。另外，新的更接近皮肤天然结构的培养和构建方法正在形成。如尸体皮加培养的自体表皮细胞联合移植的应用，以不同支持物培养细胞的应用，以及角质细胞培养方法的变更[10]。

参考文献

1．李牧尧等，灰白鼠细胞系的建立及部分生物学特征的观察，新疆医学院学报1988；if（l）： 7

2．Freemann AE，et al．Growth and Characterization of human skin epithelial cell Cul－ ture sin vitro．J Invest Derml976；12：352

3． Green H, et al．Growth of cultured human epldermal cells into multiple eplthelia suitable for gfofting．Proc Nat Acad Set 1979． 76：5665

4．Gallico GG．et al．Permanent coverage of large burn wounds witn autologous cultured human epithelium New Engl J Med l984．311：448

5．Michael RM．et al grafting of cultured Allogenelc Epidermis on Second－and Third－degree Burn Wounds on 26 Patients．J．Trama 1986.26:955

6．赵雄飞等。人上皮细胞培养及其初步试用于创面。中华外科杂志1985，23：297

7．李映月等，人体表皮细胞培养和移植，上海医学 1988， 11： 249

8．方之扬主编。烧伤理论与实践，第一版。沈阳：辽宁科学技术出版社，1989；416～422

9． Pittelkow MR；et al New techniques for them vltro culture of human skin karatlnocytCs and perspectives on their use for grafting of patients with exterslve burns Mayo Clin Proc 1986；61：771

10． Phillips TJ，培养皮肤移植，国外医学一创伤与外科基本问题分册1989（3）：137

作者单位：新疆医学院一附院烧伤科

新疆医学院生物教研室