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AN EXPERIMENTAL STUDY OF CRITICAL VALUE ON THREE COMMON BACTERIA INDUCING BURN WOUND INVASIVE INFECTION

李利平 马恩庆

（内容摘要）本文选择烧伤感染中三种觉见细菌即绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，分别建立大白鼠大面积Ⅲ度烧伤感染模型。伤后各组定期处死一定量的大白鼠行心血培养，创面组织病理学检查和组织匀浆细菌定量培养。结果表明绿脓杆菌毒力，侵袭力较强，易于血行扩散，金菊球菌和大肠杆菌毒力，侵袭力较弱，不易血行扩散；绿脓杆菌导致侵袭性感染的临界量为每克组织103个，金葡球菌为104，大肠杆菌为106。

关键词：烧伤创面侵袭性感染血培养组织病理学检查细菌定量

众所周知机体内外存在大量细菌。在正常情况下人与细菌保持着微妙的平衡，这是一种定量的平衡[1]。当机体防御机制受损和／或细菌数量增加，人与细菌失去平衡时，感染随之发生。大面积深度烧伤后机体免疫机能受到抑制，而且烧伤创面是细菌理想的培养基地，创面上的细菌迅速增殖，所以，烧伤创面感染几乎是不可避免的。随着细菌量的增加，细菌可沿着汗腺、血管、淋巴等途径侵入到深部未烧伤的活组织内，从而导致侵袭性感染[2]。以往的研究认为不管何种细菌在烧伤创面组织内增殖达每克组织105或106以上时就可导致侵袭性感染，故认为105（3）（4）（5）或106（6，7）是导致侵袭性感染的临界量。但由于细菌种类繁多，毒力、侵袭力各异，因此单用105或106或某一临界量不能解释临床上绿脓杆菌组织密度在102～103时就有侵袭感染发生；而肠球菌和大肠杆菌组织密度达106至107才发生侵袭性感染的临床现象[8]。本研究根据细菌毒力、侵袭力不同的理论，选择烧伤感染中常见的绿脓杆菌、金葡球菌和大肠杆菌{9，10]进行动物实验，探索这三种细菌各自引起侵袭性感染的临界量。

材料与方法

一、动物分组及其处理：健康wistar纯种大白鼠（性别不拘，成龄）108只，随机分成三组，即绿脓杆菌组34只，金葡球菌组39只，大肠杆菌组35只。在建立烧伤感染模型后于第一、三、五、七、九天各组分别处死六只以上病情较重的大鼠，进行病理学检查、血培养和组织匀浆细菌定量培养。并在建立烧伤感染模型之前和处死之前检测、记录肛温、呼吸和精神状态等一般情况。

二、烧伤感染动物模型的建立[2]：

1．3%巴比妥钠（30mg～50mg/kg），腹内注射麻醉后剪除大白鼠背部毛发，暴露面约为体表面的15-20％。

2．固定大白鼠于动物架上，将大白鼠背部暴露区侵人恒温沸水中10秒钟造成III度烧伤创面。

3．各组大白鼠烧伤创面分别接种绿脓杆菌4176，金葡球菌26003和大肠杆菌44602悬液1毫升，隔离喂养。

三、细菌悬液的配制：取培养18小时至24小时细菌菌落与生理盐水在试管内混句后同标准浓度管比色配成细菌含量为4X108个／毫升的细菌悬液。

四、取心血培养：将大白鼠麻醉固定后去除胸腹部毛发。2％碘酒消毒一次，75％酒精消毒二次。剖开胸腔显露心脏。无菌操作下抽心血0．5毫升或1毫升放入装有4．5毫升或9毫升肉膏汤的试管内，混合后放置37℃恒温培养箱内培养七天后取少许涂布接种于普通琼脂培养皿上培养24小时看结果。如果培养皿上有细菌生长则为血培养阳性（即为侵袭性感染）[2].

五、取创面组织标本：大白鼠麻醉后，75％乙醇消毒创面二次。于创面中央作两条平行切口长2厘米，宽1厘米，深达肌膜。组织标本一半作病理学检查，一半作组织匀浆细菌定量培养。

六、组织病理学检查：组织标本立即用10％甲醛固定，制成HE染色片和革兰氏染色片，在光学显微镜下若发现细菌侵入深部未烧伤活组织内，即为侵袭性感染（即病检阳性）[11]。

七、组织匀浆细菌定量培养[1,2]：

l．无菌操作下以分析天平称量标本。

2．为杀灭标本表面细菌，将标本快速放入99．5％异丙醇内立即迅速抽出，轻甩二下点燃燃烧5～8秒钟，再用95％乙醇重复二次。

3．将标本和等于标本重量9倍的肉膏汤放入无菌玻璃匀浆器，电动匀浆制成浓度为1／10的匀浆液。

4．取四个血琼脂培养皿分别按序标上“2”，“4”，“6”，“8”字码。取无菌试管三支分别装肉膏汤9.9毫升并按序编上“l”，“2”，“3”字码。

5．用自动微量吸管取匀浆液0．l毫升涂布接种于“2”培养皿上，另取0．l毫升匀浆液放人“l” 管内，混匀后，取外1毫升涂布接种于“水培养皿上，如此法接种于“6”和“8”培养皿。

6．将四个培养皿放入37C恒温培养箱内培养24小时看结果，即根据菌落特征或涂片确定细菌性质。根据菌落数量确定组织细菌密度；如在“2”培养皿上有l－9个菌落则结果为l－9X 102，如菌落数＞10个则结果为每克组织含103个细菌。同理有104，105…100

结果

一、血培养结果：血培养阳性共42例，总阳性率为39％（42／108）。绿脓杆菌组阳性率为 68%（2／34）；金葡球菌组阳性率26%（10／39）；大肠杆菌组阳性率为26％（9／35）。 经比较，差异显著（X2=17．27，P＜0．005）。表明绿脓杆茵对血管的侵袭力较强，易于血行扩散，大肠杆菌和金葡球菌对血管的侵袭力较弱，不易血行扩散。

二、时间与侵袭性感染：伤后第一天就有侵袭性感染发生。绿脓杆菌组第一天侵袭性感染率为86％，金葡球菌组侵袭性感染率67％，大肠杆菌组为11％。绿脓杆菌组与大肠杆菌组侵袭性感染率比较，差异显著，P=0．009；金葡球菌组与大肠杆菌组侵袭性感染率比较，差异不显著，P=0．024；绿脓杆菌组与金葡球菌组侵袭性感率比较，差异不显著，P＝0．565（均为列联表分析和直接概率法，检验水准=00125）（12）（13）表明绿脓杆菌毒力、侵袭力较强，大肠杆菌和金葡球菌毒力、侵袭力较弱。第三天后三组间侵袭性感染的发生没有明显差别（见表一）。

三、创面组织细菌密度与侵袭性感染发生的关系：创面组织细菌密度增加，侵袭性感染的发生有相应增加的趋势。经相关分析表明组织细菌密度与侵袭性感染呈正相关（rs=0．86， P＜0、05）（见表二）。

四、细菌临界量的确定：根据临床流行病学介绍的断点分析法（14），分别计算各组每一组织细菌密度断点的敏感性和特异性绘制ROC曲线（Receiver Operating Characteristic Curve）。在ROC曲线图上找到最佳组织细菌密度断点作为临界量。结果绿脓杆菌导致烧伤侵袭性感染的临界量为每克组织103，金葡球菌为104，大肠杆菌为106.

讨论

烧伤侵袭性感染的发生除与烧伤机体防御机制受损有关外，还与细菌因素有关（包括细菌性质和组织细菌含量）。我们的研究结果表明创面组织内细菌密度与烧伤侵袭性感染有正相关关系。MacMillan[15]等也认为随着创面组织内细菌密度的增加，细菌在创面组织内侵袭的深度加深。以往认为不管何种细菌其组织密度达105[4，5]或106[6，7]以上就可导致侵袭性感染。我们的研究结果则表明毒力、侵袭力强弱不同的细菌导致侵袭性感染的组织细菌密度不一。

绿脓杆菌是一种条件致病菌，一般情况下不致病，一旦获得致病条件如大面积深度烧伤后，就迅速增殖，同时产生毒力，侵袭力强的致病物质如：溶蛋白酶类、致死毒素、杀白细胞素等，使细菌容易向深部组织侵袭，且侵犯血管力强，易于血行扩散，即使组织细菌密度较低亦可导致侵袭性感染。本研究结果表明绿脓杆菌导致侵袭性感染的临界量为103。金黄色葡萄球菌是致病性细菌，其主要的致病物质为毒素和酶。如溶血毒、杀白细胞素和肠毒素、血浆凝固酶、透明质 酸酶等等，这些致病物质均利于细菌增殖和向深部组织扩散。但我们的研究结果显示金葡球菌对血管的侵犯力较弱，不易血行扩散，导致侵袭性 感染的临界量本研究为104。大肠杆菌是寄居性细菌，其毒力、侵袭力较弱，不易血行扩散，导致侵袭性感染的临界量本文为106。

本文细菌临界量的确定是在ROC曲线上综合考虑敏感性和特异性，选择不仅敏感性高而且特异性高的细菌密度断点作为临界量。因为侵袭性感染一旦发生就难以逆转，所以要尽量提高敏感性，减少漏诊。本文ROC曲线图显示绿脓杆菌、金葡球菌、大肠杆菌最佳的组织密度断点分别为103，104，106，故分别作为绿脓杆菌、金葡球菌和大肠杆菌各自导致侵袭性感染的临界量。

应用103，104和106来推断不同细菌引起的侵袭性感染，误诊10例，漏诊6例，Kapps＝0.58；如果单用105或106来推断各种细菌引起的侵袭性感染误诊分别为10例或7例，漏诊分别为16例或23例，kaPPa＝0．40或kappa＝0．38，即漏诊明显增加，kappa值明显降低（亦即可靠性差，一致性降低）。因此，我们认为单用105或106作为任何细菌引起烧伤侵袭性感染的临界量过于笼统。

结论

毒力、侵袭力强弱不同的细菌导致侵袭性感染的临界量高低不一，绿脓杆菌临界量为103， 金葡球菌临界量为104，大肠杆菌临界量为106。

参考文献

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作者单位：湖南医科大附一医院

衡阳医学院附一医院