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作者单位：510800广东广州，广州市中西医结合医院烧伤外科（刘平洪，刘树华）；730000甘肃兰州，甘肃省人民医院烧伤整形科（薛晓东） 

【摘要】  目的  了解我院烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 基因型及其耐药性，为我院烧伤病房MRSA 感染的防治及分子流行病学研究提供实验依据。方法  采用K-B琼脂扩散法做抗菌药物敏感实验，用聚合酶链反应(PCR) 方法扩增MRSA mec 基因以及MRSA mec 基因高变区(HVR)，根据扩增片段大小的差异进行基因分型，分析基因型与耐药性的关系。结果  我院烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌携带mec耐药基因，mec 基因携带率为87.5%，HVR分型只有A、C 两种分型，分别为20.3 %、78.8%。结论  我科烧伤病房耐甲氧西林金黄色葡萄球菌HVR分型只有A、C 两种分型,以C 型多见。

【关键词】    甲氧西林金黄色葡萄球菌；mec耐药基因；HVR 基因

【标识符】    doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2011.04.004

【文章类型】  论著 

【Abstract】Objective  To explore the genotype and drug tolerance of MRSA (Methicinlin-resistant Staphylococus Aureus) in a purpose to provide the experimental evidence for prevention and treatment of MRSA infection in burn ward as well as studies on molecular epidermics. Methods  Perform the antimicrobial medication sensitive test with K-B agar diffusion method, augment gene MRSAmec and its Hypervariable Region (HVR) by Polymerase Chain Reaction (PRC). And then analyze the relation between genotype and drug tolerance based on the size differences among augmented gene sections. Results  There was MRSA carrying drug resistant gene mec in the burn ward of our hospital, with the carrying rate of mec gene being 87.5%. There were only type A and type C of HVR counting up 20.3% and 78.8% respectively. Conclusion  There were only type A and type C in MRSAmec HVR in the burn ward of our hospital, and type C was the prevalent type.

【Key words】Methicinlin-resistant Staphylococus Aureus (MRSA); drug resistant gene mec; Gene HVR 

金黄色葡萄球菌(SAU) 是引起烧伤患者感染的最常见病原菌之一。随着大量广谱抗菌药物在临床的广泛应用，烧伤患者感染金黄色葡萄球菌的耐药性也不断增强。近年来, 烧伤患者感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 的分离率一直呈较高水平^[1~3]。预防SAU引起的院内感染也一直是院内感染控制的重要工作之一。为了解我院烧伤患者感染SAU的耐药性和耐药基因的携带状况，对我院2009年1月～2010年4月院内感染分离的SAU做了16种抗菌药物耐药性检测，并对其中24 株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA) 和16 株MRSA进行了mec 基因耐药基因的检测以及HVR基因分型的研究，现报道如下：

1.材料与方法

1.1.菌株 

40株金黄色葡萄球菌于2009年1月～2010年4月收集于广州市中西医结合医院烧伤科，其中17株来自患者创面分泌物，15株来自痰标本，8株来自静脉导管；质控菌株铜绿假单胞菌ATCC25922、大肠杆菌ATCC25922，标准大肠杆菌DH5αPCR阳性对照菌株由甘肃省检验中心提供。

1.2.仪器与试剂 

PTC-200PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司产品），DYY-613型电泳仪（北京六一仪器公司产品）。 引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，即用型PCR试剂盒2.0(由天泽基因工程有限公司提供)；DNA Marker c 、DNA Marker均购自上海生物工程技术服务有限公司；16种药敏纸片：头孢他啶（CAZ,30 μg），亚胺培南（IPM,10 μg），头孢噻肟（CTX,30 μg），阿米卡星（AK,30 μg），氨曲南（ATM,30 μg）等购自广州迪景公司。  

1.3.药敏试验

采用K-B法进行抗菌药物敏感性试验，并根据CLSI/NCCLS 2007年标准进行抗菌药物敏感性判断，质控菌株为：铜绿假单胞菌ATCC25983和大肠杆菌ATCC25922。

1.4.基因组DNA的制备

从培养MRSA的营养琼脂平板上挑取少许培养菌，接种于3ml LB肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜，运用煮沸法提取细菌基因组DNA：挑取适量细菌放入含有700 μL的无菌蒸馏水1.5mL EP管中，95℃水浴10 min，7000r/min 离心10min，抽取上清液即为模板，-20℃保存备用。

1.5.耐药基因的扩增 

参照文献^[4~7]报道，设计引物经Primer 引物设计程序验证，由上海生物工程技术服务有限公司合成（见表1），运用即用型PCR试剂盒扩增目的基因。

1.5.1. 扩增mec 基因反应体系PCR Magicmix2.0  15 μL、上下游引物（P1、P2浓度为20 μmol/L）各1 μL、模板3 μL、双蒸水15 μL，总体积为35 μL。

1.5.2.扩增HVR 基因型反应体系PCR Magicmix2.0  15 μL、上下游引物（P3、P4浓度为20 μmol/L）各1 μL、模板3 μL、双蒸水20 μL，总体积为40 μL。

表1 扩增目的基因引物序列表

Table 1  Sequence of augmented gene primer

1.5.3.扩增mec基因93℃预变性2 min，然后93℃变性60 s，55℃变性60 s，72℃变性60 s，循环35 周期，最后72℃延伸2 min，PCR扩增产物作2%琼脂糖凝胶电泳，出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性，并摄像保存。

      1.5.4.HVR 基因型的扩增94℃变性5 min，94℃变性1 min，72℃延伸2 min，共30 个循环，最后一个循环72℃延伸10 min。扩增产物为经含0.5 μg溴化乙锭的琼脂糖电泳30 min，在荧光紫外灯下观察结果。

2.结果

2.1.耐药率　

所有金黄色葡萄球菌对16种抗菌药物的耐药率除万古霉素为0外，对其他15 种抗菌药物均有不同程度的耐药,2种基因型对16种抗菌药物的耐药率见表2。

2.2.耐药基因携带率

即mecA阳性检出率为87.5%。mecA基因PCR电泳图见图1。

表2  2种MRSA 基因型对16 种抗菌药物的耐药率(%)

Table 2  Drug resistant rate of two MRSA genotypes against  16 types of antibiotics (%)

2.3.MRSA HVR 分型　

MRSA HVR 扩增产物经电泳后观察到400 bp～600 bp 大小不同的条带。据此将40 株MRSA 分为A、C 2种基因型,分别占 20.3%、78.8%，其中以C 型(78.8%) 居多（见图2）。

3.讨论

mecA 基因源自松鼠葡萄球菌，只存在于葡萄球菌中，位于一个由不同整合子、转座子等组成的可移动元件SCC mec 上，是MRSA 的耐药决定基因。mec 基因的高变区的dru 序列扩增，位于mecA与IS431 mec 之间、长约2040 bp 的片段，它由一个40 bp 直接重复单位重复1次～9次而构成，在不同的MRSA 菌株中dru 重复次数不同，决定了MRSA 基因的多态性，成为基因分析的分子基础^[7]。mecA 基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有的，而HVR 基因高变区与该基因紧密相连，只存在于其下游，也具有特异性。MRSA 对β-内酰胺类抗菌药物耐药主要是由于macA 基因编码的PBP2a 蛋白代替原来的青霉素结合蛋白PBP2,造成β-内酰胺类药物结合靶位的缺失而形成耐药，本研究据HVR 多态性将我院烧伤科收集的40株MRSA 分为2型，以C 型多见，A 型少见。从表2中可见基因型为C 型的MRSA对喹诺酮类抗菌药物的耐药率高于基因型为A 型的MRSA，而基因型为A 型的MRSA对β-内酰胺类抗菌药物的耐药率高于基因型为C型的MRSA。通过上述研究，我们可以在以后的治疗过程中通过试验得出患者感染的MRSA的基因型，然后通过基因型的耐药特点有针对性的选择抗菌药物提高治愈率，使患者创面早日原位再生复原，减轻患者愈合后创面的瘢痕。再者，通过试验记录观查到携带同一种基因型的MRSA菌株80%来自同一病房，这从侧面可以得出这与患者之间的交叉感染有关。因此在以后的治疗过程中，应该高度注意患者间的交叉感染情况，避免耐药菌株的流行。同时表明加强对细菌耐药性的监测，合理和谨慎使用抗生素等是防治烧伤感染的关键措施^[8]。皮肤原位再生医疗技术专用药品湿润烧伤膏（MEBO）属于非杀菌控制细菌和毒素感染^[9]的药物，故认为MEBO是符合当代综合抗感染模式的局部理想治疗药物^[10]。

从mec 基因型研究的结果与其他学者关于mec基因型研究的结果相比较，我们研究菌株检测到的基因型的分型较少，这表明虽然我们分离出的MRSA数量相对较多，但它们的HVR 基因分型却较少，造成这种现象的主要原因就是携带有耐药基因的菌株在病房之间互相传播造成的。

对于MRSA 与多药耐药( multidrug resistance ,MDR)，最近国内学者报道葡萄球菌已是院内感染分离率最高的细菌，其中MRSA 占较高比例[7]。MRSA 因其具有MDR 特征和携带多种毒力因子(毒素，如TSST、SEC 等) 已成为烧伤患者临床治疗的难点，而MEBO通过隔离细菌、限菌、抑菌、流动排菌、细菌误食MEBO后变异降低毒力等过程达到抗感染的目的^[11]。在此基础上，进一步研究它携带的耐药基因，以及耐药基因分型的研究对MRSA 流行病学调查和指导临床用药有重要的意义。

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（收稿日期：2011-03-23）