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EXPERIMENTAL RESEARCH ON THE ANTI－INFECTIVE MECHANISM OF MEBO

滨州医学院 曲云英 王运平 邱世翠 胡涛 郝恩柱

〖内容摘要〗本文研究了变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等在含有一定浓度的湿润烧伤膏（MEBO）培养基上经连续传代后生物学特性的变异现象，MEBO与抗生素的协同抑菌作用；MEBO可提高小鼠外周血WBC总数、PMN百分数和小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬功能。实验结果说明MEBO可引起烧伤感染常见细菌的变异和提高机体的非特异免疫功能，它对研究MEBO的抗感染机理有重要意义。

关键词：MEBO细菌变异 协同抑菌 非特异性免疫

临床资料表明，MEBO有明显的抗菌消炎作用。我们在1992年5月－6月对临床14例MEBO治疗的烧伤病人进行细菌分离培养检查时，观察到变形杆菌出现了形态H－O的变异，金黄色葡萄球菌血浆凝固能力减弱等变异现象。为了进一步探讨MEBO的抗感染机理，我们通过对烧伤感染常见细菌（变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）在含有一定浓度的MEBO培养基上生物学特性的变异现象，和对机体非特异性免疫功能的影响进行了实验研究。

一、 材料和方法

（一） 临床资料

1992年5－6月从14例经MEBO治疗的住院（4－20天）烧伤病人的创面上MEBO药层的上层和下层（接近烧伤创面）于换药前分别取标本进行细菌分离培养，观察细菌形态及菌落特点，凝固血浆的能力等。

（二） 试剂、菌种及方法

湿润烧伤膏（MEBO），北京光明中医烧伤创疡研究所研制。抗生素药敏试验滤纸片，上海医化所制。营养琼脂，上海医化所试剂厂制。变形杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，由本室提供。

将上述四种细菌分别接种在含一定浓度的MEBO培养基上，连续传代10－15代，分别进行生物学特性的观察。在普通培养基上和含有一定浓度MEBO的培养基上分别接种上述四种细菌，以药敏纸片法作药敏试验。

（三） 实验动物分组及方法

健康小鼠40只，由本院动物园提供，体重20－24克，雌雄不拘。随机分组，I组为空白对照组，II组为液体石腊对照组，II组为MEBO试验组。在试验组小鼠背上部约2．5×2．5cm 的无毛区涂抹MEBO，每日二次，共10天。II组方法同III组。然后，给小鼠腹腔注射2％绵羊细胞0．5 ml，30min后处死民，检测。

（四） 检测指标

1． 细菌变异现象的观察    上述四种细菌分别接种在含一定浓度MEBO的培养基上，连续传代培养，18－24小时为一代，每代分别进行有关的生物学特性的观察。用暗视野显微镜观察细菌动力。革兰氏染色观察细菌的染色反应和形态特点。观察细菌菌落特点，生化反应，血浆凝固酶试验等。

2． 核质染色法    将传代至第7代变异成长丝状的变形杆菌涂片，1％钼酸水溶液蒸气固定，1％盐酸56C 5min 水解RNA，吕氏美兰染色，观察结果。

3． 抗生素药物敏感试验测定    将上述四种细菌分别接种在普通琼脂培养基上，和含有20％浓度的MEBO培养基上，贴上八种抗生素（庆大霉素、新霉素、红霉素、羧苄青霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、氯胺苯醇和多粘菌素）药敏纸片，经24h ，观察抑菌作用，测量其抑菌环直径。

4． 小鼠腹腔吞噬细胞吞噬功能的测定    对照组和试验组小鼠于试验的第11天分别给予绵羊红细胞腹腔注射，30min后，取小鼠腹腔液涂片，Wright 氏染色，计算吞噬细胞的吞噬百分率。

5． 小鼠腹腔液和血清溶菌酶的测定    采用琼脂平皿法，取微球菌液（90亿／ml ）2ml 加入冷至70C 1％琼脂中充分混匀，倾注培养皿内，待冷却后打孔（孔径3mm ），一组培养皿孔内分别加入对照组和MEBO试验组小鼠血清，另一组培养皿孔内分别加入二组小鼠的腹腔液。置37C温箱24h取出，测溶菌环的直径。

6． 小鼠外周血白细胞总数及分类的检测    分别于对照组和试验组的小鼠断尾取血，按常规方法进行白细胞计数，同时涂血片，Wright 氏染色，计算中性粒细胞的百分数。

二．结果

（一） 从临床烧伤病人创面分离的细菌种类和变异现象（见表1）

从表1可看出，临床烧伤病人经MEBO治疗后，烧伤创面的变形杆菌出现形态结构H－O的变异。金葡菌由血浆凝固酶试验阳性到凝固酶试验阴性或凝固血浆能力减弱。

（二） MEBO的抑菌试验

观察了在普通琼脂平皿上，用挖沟灌药，细菌划线接种法和在接种细菌的表面贴上含有MEBO的滤纸片法，对金葡菌、白葡菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、副伤寒甲杆菌和痢疾杆菌等八种细菌的抑菌作用。结果表明，MEBO无直接抑菌和杀菌作用。这可能与含脂性的MEBO不易渗入含水成分的培养基中有一定的关系。

（三） MEBO对细菌生物学特性的影响

1、 对变形杆菌生物学特性的影响（见表2）在含一定浓度的MEBO培养基上，经连续传代培养后，变形杆菌可观察到动力减弱到消失和出现H－O的变异。经传代到第7代出现明显的长丝状形态变异，尤其在含25％的MEBO培养基上，约90％变形杆菌成长丝状或长杆状变异，继之呈较小杆菌，菌体出现着色深的颗粒，菌落小，细菌生长缓慢，对葡萄糖，乳酸迟缓分解。

2、 对变形杆菌H抗原的影响（见表3）

3．MEBO对绿脓杆菌生物学特性的影响（见表4）

从表4中可看出，绿脓杆菌在含一定浓度的MEBO培养基上，从第5代开始动力减弱，第10代后消失，细菌形态和菌落都出现了变异现象。

4．MEBO对大肠杆菌生物学特性的影响（见表5）从表5中可看出在含一定浓度的MEBO培养基上，大肠杆菌经传代培养10代后，可出现明显动力消失，细菌形态近乎圆球形，菌落小较干燥扁平。同时对葡萄糖、乳糖出现迟缓分解（32小时以后）。

5．MEBO对金葡菌生物学特性的影响（见表6）从表6可见金葡菌在含MEBO培养基上传代10代后，镜检可看到除部分呈小的葡萄状堆集排列外，有许多散在的双球菌或短链状的球菌。菌落由中等大小光滑型菌落，经在含MEBO培养基上连续传代后，可逐渐变得较小和较干燥扁平。对甘露醇迟缓分解（32小时以后），尤其是凝固血浆的能力发生明显变异。（见表7）。

表6 MEBO对金葡菌生物学特性的影响

血浆凝固酶试验，液体清，出现明显凝块"++ "液体稍混浊，出现较细小凝块"+"液体较混浊，凝集块小而少"士"。

7． 变形杆菌细胞核质的染色观察 用在含有25％的MEBO培养基上传代培养第7代呈长丝状变异的变形杆菌进行细胞核质染色。因胞浆中RNA被水解，核质颗粒被染成兰色，油镜下可见到兰色颗粒间隔一定距离，呈长杆状或长丝状排列的似多核长丝状杆菌。实验结果说明在细菌二分裂过程中，由于细菌的细胞膜、细胞壁形成及内陷的速度迟于胞浆核质的分裂速度、细菌成长杆状或长丝状。在含MEBO培养基上继续培养，镜下可见到全是较小杆菌，这是由于核质分裂速度减慢与细菌细胞膜、细胞壁的形成及内陷的速度同步进行。实验说明细菌在含有一定浓度的MEBO培养基上生长繁殖速度明显减慢。

7． EBO与抗生素的协同抑菌作用（见表7）

表7 MEBO与抗生素的协同抑菌作用

由表7可见，绿脓杆菌对羧苄青霉素、氯胺苯醇耐药，而在含有20％MEBO培养基上呈中度敏感。变形杆菌对氯胺苯醇、氨苄青霉素耐药，而在含MEBO培养基上敏感。对大肠杆菌羧苄青霉素、卡那霉素与MEBO有协同抑菌作用。对金葡菌羧苄青霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素等与MEBO都有协同抑菌作用。

（五） MEBO对小鼠非异性免疫功能的影响

1． 对小鼠外周血白细胞的影响（见表8）

表8 MEBO对小鼠外周血白细胞的影响

从表8中看出，MEBO可使小鼠外周血WBC和PMN％增多，与对照组相比有显著差异。

2． 对小鼠腹腔吞噬细胞功能和溶菌酶的影响（见表9）

从表9可见，MEBO能提高小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬功能和溶菌酶的作用，与对照组对比有显著差异。

三．讨论

烧伤湿润暴露疗法与MEBO已在临床烧伤创疡病人广泛应用，解决了治疗烧伤创面的四大技术难题。通过平皿法的抑菌试验观察说明MEBO无直接杀菌和抑菌作用，这可能与油脂性的MEBO在含水分的培养基中不易渗入和扩散有关。通过实验观察说明了细菌在含有一定浓度的MEBO培养基上连续传代培养后，可引起的细菌形态结构等生物学特性的变异。细菌菌落的变异导致细菌的生化反应，抗原性和细菌毒力等方面的变异。细菌与其生存环境有着密切的关系。生长旺盛的细菌胞浆是均匀的。衰老的细菌染色后菌体可见着色深的颗粒，如变形杆菌、绿脓杆菌。休眠或濒死的杆菌常近似于圆球形，如大肠杆菌。以上的变异现象，实验证明为非遗传性变异。MEBO与抗生素有协同抑菌作用（见表6），这有利于烧伤创面及全身细菌感染的控制。实验结果还显示了MEBO能增强小鼠腹腔吞噬细胞的吞噬功能和溶菌酶的释放，能使外周血白细胞总数和中性粒细胞增多，这对清除局部创疡的细菌和血流中的细菌及其毒性产物起重要作用。综上所述，MEBO的抗感染机理是通过对烧伤感染常见细菌生物学特性的变异和减慢了细菌生长繁殖的速度，而导致细菌致病性的降低和提高了机体的非特异性免疫功能达到抗感染作用。

参考文献

〖1〗 张林祥等，烧伤湿润暴露疗法2076例临床调查报告。中国烧伤创疡杂志，1989，1：22

〖2〗 上海市医学化验所，抗生素药物敏感试验，1983

〖3〗 余贺主编，医学微生物学，1983，13～28，239

〖4〗 汪美先主编 ，医学微生物学与免疫学，1989，116