郭泽兴1,李红玉2
【摘要】 目的:建立随机扩增多态性DNA (RAPD)基因分型方法监测重症监护室铜绿假单胞菌(PA)医院感染。方法:收集一年内从重症监护病房(ICU)分离出的21株铜绿假单胞菌,提取DNA后进行RAPD分型,同时进行抗生素敏感性实验。结果:21株PA共得14型,分型率100%;其中有3株属于同一种类型;抗生素敏感性实验表明21株均为对亚胺培南/西司他丁,头孢哌酮/舒巴坦等少数几种敏感的多重耐药株。结论:ICU内存在铜绿假单胞菌感染爆发流行,RAPD分型技术分型率高,简便快速,具有分子流行病学研究的应用价值。
【关键词】铜绿假单胞菌;随机扩增多态性DNA;医院感染
【中图分类号】R18;R197.3【文献标识码】A【文章编号】1001-0726(2008)04-0273-03
Epidemiological Research on Chloropseudomonas Random Augmentation Polymorphism DNA Molecules.GUO Ze-xing1,LI Hong-yu2.1.Clinical laboratory of Dali Hospital of Nanhai District,Foshan City,Guangdong Province,528231,China; 2.Clinical Laboratory of the Second Hospital Affiliated with the Sun Yat- Sen University, Guangzhou City, Guangdong Province,528231,China
【Abstract】 Objective:To establish a method of randomized augmentation polymorphism DNA (RAPD) gene typing to monitor chloropseudomonas infection in ICU Method: 21 chloropseudomonas strains collected and isolated from ICU during one year were typed in RAPS after refining DNA and were carried out the bacterial sensitivity test as well Results:14 types in 21 PA strains were obtained with typing rate 100%; 3 of 21 strains belonged to the same type; the bacterial sensitivity test indicated that all the 21 strains were sensitive to a few multiple drug-resistant strain, such as imipenem/cilastatin,cefoperazone/sulbactam,etc Conclusion:There were Chloropseudomonas infection eruption in ICU RAPD typing technique has a molecule epidemiology application value with high typing rate, simple and quick
【Key words】 Chloropseudomonas; Random augmentation polymorphism DNA; Hospital infection
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)属条件致病菌,耐药性强,为医院感染的重要致病菌之一,常引起医院感染的爆发与流行,其发病呈上升趋势[1],尤其PA的多重耐药菌株,是引起医院内感染甚至大规模爆发流行的重要条件致病菌[2,3]。在监测PA细菌耐药表型同时,采用高分辨力且精确快速的分型技术对于PA医院感染的流行病学调查和检测,以及对院内感染的监控及阻断极为重要。近年出现的随机扩增多态性DNA(randomly amplified polymorphic DNA,RAPD)技术已广泛用于细菌等微生物的基因分型[4,5]。为了解本院PA引起院内重症监护室感染的状况,本研究采用优化反应体系的RAPD法,对21株来自医院内ICU病房的PA进行分型,并观察耐药情况,为该菌感染的分子流行病学分析提供科学依据。
一、材料
1.菌株来源:2007年1月~12月,医院ICU住院患者的痰、血、胆汁培养分离的PA21株,样本主要来自烧伤科、脑外科、神经内科、呼吸科等病房。
2.试剂:随机引物272(5′-AGCGGGCCAA-3′)由上海博亚生物公司合成;Taq DNA 聚合酶,dNTP,PCR反应配套试剂盒及DNA Marker DL 2000均由Takara公司提供。
3.仪器:MJ(America)公司PTC-200型PCR仪;Eppendorf 5415D离心机;UVP(America)公司GELDOC-200型凝胶成像系统;BIO-RAD(America)公司Power-pac Basic 水平电泳槽,电泳仪。
二、方法
1.菌株鉴定:所有PA均经法国生物梅里埃公司API细菌鉴定系统鉴定。
2.RAPD分型:(1)模板DNA制备:从哥伦比亚血平板上取适量菌落溶于400μl灭菌双蒸水中,调整菌体浊度为5个麦氏单位,置PCR仪中
三、结果
1.RAPD基因分型结果:采用RAPD分型法对我院2007年1月~12月ICU分离的21株PA进行分型,全部菌株均能产生指纹图谱,分型率100%,重复实验的分型结果基本一致。扩增DNA片段数目为1~7条,最小片段为100bp,最大片段为1000bp。根据所得DNA 片段数目及大小对PA菌株进行相似度比较,21株PA菌共被分为14型:其中有9株5型分布于烧伤科,3株同型分布于神经内科,4株4型分布于呼吸科,5株3型分布于脑外科。
2.医院感染PA流行爆发的确定:同一病区或不同病区2例以上患者分离出相同基因型PA,可确诊为医院感染。同一病区不同病人检出同一PAPD型别的PA菌株,神经内科有1起。不同病区间未检出相同PAPD型别。
3.抗生素敏感性实验:ICU病房分离的PA均为多重耐药菌株,对哌拉西林、头孢菌素类、喹喏酮类、丁胺卡那等耐药,仅对亚胺培南/西司他丁,头孢哌酮/舒巴坦等少数几种敏感。
图 不同病区患者RAPD指纹图
四、讨论
RAPD是一种基于基因组多态性的基因分型方法。该法最大特点是可在模板序列未知情况下任意设计引物,而随机引物为任意10个碱基的单链寡聚核苷酸片段,通过PCR介导使所有与其互补的模板基因组DNA得到扩增,产生一系列大小不同的DNA片段,通过琼脂糖凝胶电泳而呈现出不同的DNA指纹图。对模板序列未知及任意设计引物的特点RAPD方法简便、易行;基于基因组多态性的特点使RAPD方法具有强大的分型能力。因此,该法广泛应用于细菌等微生物的基因分型和亲缘关系分析等研究,以及分子微生物学的追踪调查与医院感染的分析等。然而该方法受内、外因素影响很大,如反应体系、模板提取方法及浓度、引物种类及浓度、退火温度等。
在医院性感染中,内源性感染是通过病原体在宿主体内移位定植而直接传播;外源性感染是由病人体外的微生物而引起的,其主要途径为共同媒介物的传播,如医护人员的手、吸痰器等介入性操作器械中,常可在短时间内引起医院性感染的爆发流行[8]。同一克隆株在空间分布集中趋势,提示存在通过某一尚未识别的共同传播源传播[9],同一病区来自不同患者的PA显示相同的RAPD型别,就是医院感染局部爆发流行的证据。神经内科ICU病区发生1起不同患者检出同一RAPD型别PA菌株的情况说明,我院2007年1月~12月期间,有1起PA引起的局部爆发。但5个病区其余患者检出的PA菌株其RAPD型别各不相同,说明尚未发生院内大爆发流行。
ICU患者通常首选高效广谱抗生素进行治疗,易使一些耐药性较强的菌株得以日益增殖,并且患者免疫力低下,易引起多重耐药的条件致病菌感染;再加上患者需要频繁的护理及侵入性治疗操作,极易引起交叉感染。抗生素敏感性实验结果显示:ICU病房的铜绿假单胞菌多为多重耐药株,应引起重视。
总之,RAPD作为监测、判断医院感染的技术方法,其可行性得到很好的体现,并可进一步用于监测医院环境,包括空气培养、医护用品及医护人员手的清洁度等的检测,追踪感染源和发现传播途径,从而使医院感染得到及时且有效的控制。
参 考 文 献
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【作者简介】
郭泽兴(1976~),男(汉族),广东南海县人,1999年毕业于广东省药学院预防医学系卫生检验专业,主管技师
李红玉(1967~),女(汉族),湖南浏阳县人,1989年毕业于湖南医科大学,副主任技师
(收稿日期: