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郭泽兴¹，李红玉²

【摘要】　目的：建立随机扩增多态性DNA （RAPD）基因分型方法监测重症监护室铜绿假单胞菌（PA）医院感染。方法：收集一年内从重症监护病房（ICU）分离出的21株铜绿假单胞菌，提取DNA后进行RAPD分型，同时进行抗生素敏感性实验。结果：21株PA共得14型，分型率100%；其中有3株属于同一种类型；抗生素敏感性实验表明21株均为对亚胺培南/西司他丁，头孢哌酮/舒巴坦等少数几种敏感的多重耐药株。结论：ICU内存在铜绿假单胞菌感染爆发流行，RAPD分型技术分型率高，简便快速，具有分子流行病学研究的应用价值。

【关键词】铜绿假单胞菌；随机扩增多态性DNA；医院感染

【中图分类号】R18；R197.3【文献标识码】A【文章编号】1001-0726（2008）04-0273-03

Epidemiological Research on Chloropseudomonas Random Augmentation Polymorphism DNA Molecules．GUO Ze-xing1，LI Hong-yu2．1．Clinical laboratory of Dali Hospital of Nanhai District，Foshan City，Guangdong Province，528231，China； 2．Clinical Laboratory of the Second Hospital Affiliated with the Sun Yat- Sen University， Guangzhou City， Guangdong Province，528231，China

【Abstract】 Objective：To establish a method of randomized augmentation polymorphism DNA (RAPD) gene typing to monitor chloropseudomonas infection in ICU Method： 21 chloropseudomonas strains collected and isolated from ICU during one year were typed in RAPS after refining DNA and were carried out the bacterial sensitivity test as well Results：14 types in 21 PA strains were obtained with typing rate 100%； 3 of 21 strains belonged to the same type； the bacterial sensitivity test indicated that all the 21 strains were sensitive to a few multiple drug-resistant strain， such as imipenem/cilastatin，cefoperazone/sulbactam，etc Conclusion：There were Chloropseudomonas infection eruption in ICU RAPD typing technique has a molecule epidemiology application value with high typing rate， simple and quick

【Key words】  Chloropseudomonas； Random augmentation polymorphism DNA； Hospital infection

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)属条件致病菌，耐药性强，为医院感染的重要致病菌之一，常引起医院感染的爆发与流行，其发病呈上升趋势^［1］，尤其PA的多重耐药菌株，是引起医院内感染甚至大规模爆发流行的重要条件致病菌^[2，3]。在监测PA细菌耐药表型同时，采用高分辨力且精确快速的分型技术对于PA医院感染的流行病学调查和检测，以及对院内感染的监控及阻断极为重要。近年出现的随机扩增多态性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）技术已广泛用于细菌等微生物的基因分型^［4，5］。为了解本院PA引起院内重症监护室感染的状况，本研究采用优化反应体系的RAPD法，对21株来自医院内ICU病房的PA进行分型，并观察耐药情况，为该菌感染的分子流行病学分析提供科学依据。

一、材料

1．菌株来源：2007年1月~12月，医院ICU住院患者的痰、血、胆汁培养分离的PA21株，样本主要来自烧伤科、脑外科、神经内科、呼吸科等病房。

2．试剂：随机引物272（5′-AGCGGGCCAA-3′）由上海博亚生物公司合成；Taq DNA 聚合酶，dNTP，PCR反应配套试剂盒及DNA Marker DL 2000均由Takara公司提供。

3．仪器：MJ（America）公司PTC-200型PCR仪；Eppendorf 5415D离心机；UVP（America）公司GELDOC-200型凝胶成像系统；BIO-RAD(America)公司Power-pac Basic 水平电泳槽，电泳仪。

二、方法

1．菌株鉴定：所有PA均经法国生物梅里埃公司API细菌鉴定系统鉴定。

2．RAPD分型：（1）模板DNA制备：从哥伦比亚血平板上取适量菌落溶于400μl灭菌双蒸水中，调整菌体浊度为5个麦氏单位，置PCR仪中95℃15min，12000×g离心15min，取上清备用。（2）扩增：体系总体积25μl，含引物（20μM）2μl，dNTP（终浓度200μM）2μl，Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.5μl，模板DNA2μl，10×PCR缓冲液（Mg2+4mM）2.5μl，置PCR仪95℃预变性5min，〔95℃45S，36℃45S，72℃2min〕×40循环，72℃10min。（3）产物检测：取扩增产物5μl，于2%琼脂糖凝胶（含溴化乙锭）电泳，5V/cm×3h。透射式紫外分析仪观察并拍照，采用DNA Marker作为分子量参照物。（4）分型标准^[6，7]：以每一分离物的所有可见带具有相同的移动距离定为一型，带的形状移动的距离不同或所有可见带的移动距离相同但缺少两条带以上定为另一型。

三、结果

1．RAPD基因分型结果：采用RAPD分型法对我院2007年1月~12月ICU分离的21株PA进行分型，全部菌株均能产生指纹图谱，分型率100%，重复实验的分型结果基本一致。扩增DNA片段数目为1~7条，最小片段为100bp，最大片段为1000bp。根据所得DNA 片段数目及大小对PA菌株进行相似度比较，21株PA菌共被分为14型：其中有9株5型分布于烧伤科，3株同型分布于神经内科，4株4型分布于呼吸科，5株3型分布于脑外科。

2．医院感染PA流行爆发的确定：同一病区或不同病区2例以上患者分离出相同基因型PA，可确诊为医院感染。同一病区不同病人检出同一PAPD型别的PA菌株，神经内科有1起。不同病区间未检出相同PAPD型别。

3．抗生素敏感性实验：ICU病房分离的PA均为多重耐药菌株，对哌拉西林、头孢菌素类、喹喏酮类、丁胺卡那等耐药，仅对亚胺培南/西司他丁，头孢哌酮/舒巴坦等少数几种敏感。

图　不同病区患者RAPD指纹图

四、讨论

RAPD是一种基于基因组多态性的基因分型方法。该法最大特点是可在模板序列未知情况下任意设计引物，而随机引物为任意10个碱基的单链寡聚核苷酸片段，通过PCR介导使所有与其互补的模板基因组DNA得到扩增，产生一系列大小不同的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳而呈现出不同的DNA指纹图。对模板序列未知及任意设计引物的特点RAPD方法简便、易行；基于基因组多态性的特点使RAPD方法具有强大的分型能力。因此，该法广泛应用于细菌等微生物的基因分型和亲缘关系分析等研究，以及分子微生物学的追踪调查与医院感染的分析等。然而该方法受内、外因素影响很大，如反应体系、模板提取方法及浓度、引物种类及浓度、退火温度等。

在医院性感染中，内源性感染是通过病原体在宿主体内移位定植而直接传播；外源性感染是由病人体外的微生物而引起的，其主要途径为共同媒介物的传播，如医护人员的手、吸痰器等介入性操作器械中，常可在短时间内引起医院性感染的爆发流行^［8］。同一克隆株在空间分布集中趋势，提示存在通过某一尚未识别的共同传播源传播^［9］，同一病区来自不同患者的PA显示相同的RAPD型别，就是医院感染局部爆发流行的证据。神经内科ICU病区发生1起不同患者检出同一RAPD型别PA菌株的情况说明，我院2007年1月~12月期间，有1起PA引起的局部爆发。但5个病区其余患者检出的PA菌株其RAPD型别各不相同，说明尚未发生院内大爆发流行。

ICU患者通常首选高效广谱抗生素进行治疗，易使一些耐药性较强的菌株得以日益增殖，并且患者免疫力低下，易引起多重耐药的条件致病菌感染；再加上患者需要频繁的护理及侵入性治疗操作，极易引起交叉感染。抗生素敏感性实验结果显示：ICU病房的铜绿假单胞菌多为多重耐药株，应引起重视。

总之，RAPD作为监测、判断医院感染的技术方法，其可行性得到很好的体现，并可进一步用于监测医院环境，包括空气培养、医护用品及医护人员手的清洁度等的检测，追踪感染源和发现传播途径，从而使医院感染得到及时且有效的控制。

参　考　文　献

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【作者简介】

郭泽兴（1976~），男（汉族），广东南海县人，1999年毕业于广东省药学院预防医学系卫生检验专业，主管技师

李红玉（1967~），女（汉族），湖南浏阳县人，1989年毕业于湖南医科大学，副主任技师