ULTRASTRUCTURAL STUDY OF STAPHYLOCCOCUS AUREUS BEING ACTED BY S—102 HERB PRESCRIPTION
研究生:吕恕
指导:文 传 陈慧贞
(内容摘望)本文通过透射电镜,观察了经S-102中药方作用后,金黄色葡萄球菌的超微结构改变。MIC(最低抑菌浓度)时,可见金菊菌中隔细胞壁连接不紧密,胞质电子密度颗粒轮廓不清。8MIC时,菌体畸型,中隔粗细不一,胞质电子密度颗粒如絮状或团块,分布不均,拟核聚集,出现较粗大的间体,有的细胞溶解,无正常分裂相,生长繁殖期与静止期均有不同程度改变,并探讨了作用机制。
随着S—102消炎止血网的开发研制,通过对S—102中药方(简称S—102)的基础实验研究和对感染创面的临床疗效观察[1,2].已初步显示了较好的抗感染作用。为进一步探讨其作用机制,我们采用透射式电子显微镜观察了S—102对金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)作用的超微结构改变,现将结果报告如下:
材料与方法
一、菌株:金葡菌15,系对青霉素耐药菌株,由中国医学科学院医药生物技术研究所提供。
二、药物:S-102粉剂由中国中医研究院广安门医院提供。
三、样品的制备:实验样品共3个:1.对照样品;2.MIC(最低抑菌浓度l.56mg/ml)的 S— 102样品; 3.8MIC(12.48mg/ml)的S—102样品。过程:先将金葡菌种入肉汤培养基过夜培养,即为原液,按1:1比例分装3个盛有同样液体培养基的烧瓶内,增菌3小时,再分别加入MIC和SMIC的S—102药粉,对照培养物不加药物,继续培养5小时;随后过滤,即为3个样品。
四、电镜标本的制作:将3个样品进行3000转/分离心15分钟,分别取沉淀物经2%戊二醛固定3小时,离心后用缓冲液洗涤数次,用锇酸固定1小时,再用缓冲液洗涤,经系列酒精、丙酮脱水后,812#树脂包埋,LKB—5型超薄切片机切片、醋酸铀、柠檬酸铅双重染色,置PHILIP—EM400型电镜下观察。
结果
一、空白对照:电镜下可见菌体呈椭圆形,细胞壁、细胞膜、细胞质及拟核结构清晰,在生长繁殖期的菌体中央见有明显而规则的细胞中隔,与外周细胞壁及细胞膜相连,厚度为外周细胞壁的一倍,中隔中央常见有一条染色较深的分裂沟,细胞质内有分布均匀的高密度电子颗粒,拟核着色较淡,分裂相多见(图1,6万倍)。
二、MIC的S-102对金葡菌超微结构的影响:有的菌体轻度变形,细胞中隔弯向一侧(图 2,6万倍)如中隔细胞壁连接不紧密,分裂沟呈串珠状(图3,7万倍);生长繁殖期与静止期胞质中电子密度颗粒轮廓不清,分布欠均;偶见间体,纹理纤细,呈同心圆规整盘绕(图4,8万倍);分裂相少见。
三、SMIC的S—102对金葡菌超微结构的影响:可使细胞结构呈多形性改变。见有菌体畸形, 细胞壁结构不清(图5、6万倍);细胞中隔扭曲畸变、粗细不一、失去连续性、分裂沟消失(图6,6 万倍);生长繁殖期与静止期胞质内电子颗粒密度降低,呈絮状或四块,分布不均;有的在核区形成染色淡的圆形空白区,中央有拟核聚集呈纤维丝状改变(图7,6万倍);在约半数的分裂中期的菌体内,出现较大的间体,纹理较僵硬,盘绕欠规整(图8,6万倍);有的菌体破溃,细胞内容物溶解、流失,遗留有膜状结构(图9,4.5万倍);见不到正常分裂相。归纳其改变见附表
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讨论
在S—102的MIC时,仅见金葡菌胞质和中隔略有改变,表明S—102使其代谢功能异常,核糖体失去均匀的颗粒结构,蛋白质的合成受到干扰,细胞分裂受限,分裂相也减少,这与所测得的MIC的细菌生长曲线呈水平状态的实验结果相吻合(2),提示药物在低浓度时,主要抑制了细菌的蛋白质合成,从而体现了抑菌药物的作用特点[3]。
8MIC时,金葡菌超微结构呈多形性改变,并各期金葡菌均受影响,说明药物作用于细菌的多个代谢环节。该药的许多成份有较强的抗菌作用,如小檗硷能抑制细菌的细胞呼吸和糖代谢过程、影响细菌对维生素B6、烟酰胺的利用,并能与DNA形成复合物,抑制DNA、RNA蛋白质及类脂的合成[4,5]。胞质和拟核的变化,可认为是药物使核区染色体性能改变,核物质产生凝集,因而不能为其转录和提供蛋白质、酶合成的信息,核糖体功能丧失甚至结构异常,集聚成四块。某些抗生素也可使菌体结构呈类似变化,有人认为这可能与抑制细菌多种酶及抑制细菌摄取氨基酸有关[6]。 另一明显改变是许多菌体的胞质内出现较大的间体。间体具有多种功能,其主要是参与DNA的复制、细胞呼吸和分裂[7]。本身形态随生理条件不同而变化[8]。根据Jacob等提出的细菌染色体合成的复制子假说,染色体复制时,首先是核的DNA附着于间体上,进一步才能使间体及核物质分裂,形成两个子细胞,可推测由于药物阻碍了染色体的复制,导致了间体自身扩张,也可因附着于间体的细胞色素和呼吸酶被抑制,引起间体代偿性增生以增加酶的含量,并形成新的间体,此时细菌正处于加速生长期,繁殖旺盛、代谢活跃,受药物作用后,便停止于分裂中期,有的出现畸变,不能继续繁殖,因此,见不到正常分裂相,生长曲线也呈下降趋势[2]。当细胞内能量减少或得不到能量时,可出现细胞内结构不清甚至自溶,所以,高浓度时可显示出杀菌作用。
S—102为中药复方制剂,经药物化学分析,除含有小檗硷、黄苓甙等有效成份外,尚有其它多种生物活性物质,药物间的相互作用更为复杂,因此,它所引起的金葡菌超微结构改变比黄连等单味药更明显和广泛,这是中药复方作用优于单味药的一个佐证,也是细菌不易对其产生耐药性的原因所在。此外,还需用药理、生化等方法进一步确定其作用机制。
(本工作承蒙中国医学科学院医药生物技术研究所娄人慧、北京市理化分析测试中心白清、孙原、辽宁省卫生职工医学院任宏造研究员的协助,谨此致谢)
参考文献
(1)文传,等,S—102消炎止血网的临床和实验研究。中国中医研究院广安门医院出席北京市科委鉴定会鉴定材料,1988。
(2)吕恕,S—102中药方治疗创伤性感染创面的临床和实验研究。中国中医研究院研究生论文,1990。
(3)花井止,海老原格。医药品再评价上抗生物质,第l版,日本医学通信社,1979;79。
(4)Shanta Nair, etc . Mechanism of Action of Berberine, Ind. J. Pharm. 1969; 31(6):173.
(5) Creasey, William A. Biochemical Effects of Berberlne, Biochem.Pharmacol.1979;28(7).
(6)张志林等,影响细胞壁合成的抗生素引起金黄色葡萄球菌超微结构的改变,上海第一医学院学报1983; 10 (5):339.
(7)B.D.Daris,Microbiology . Third edition Harper International Edition.1980; 89.
(8)WHO电子显微镜诊断学研究研修七二夕一,电子显微镜学II(实际编),第1版,日本藤田企画出版株式会社,1987;40。
(9)Jacob.F.et al:Cold Spring Harbor Symp Quan.Biol. 1964;28:329.
(10)刘锡光等,大蒜、黄连、蒲公英对金黄色葡萄球菌作用的超微结构观察。中西医结合杂志,1986,6(12);737。
本文作者系中国中医研究院广安门医院
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