目录

童庭辉，王春艳，郭力，廖毅

泸州医学院附属医院，四川 泸州 640000

【摘要】 目的：研究烫伤早期大鼠结肠平滑肌细胞骨架含量的动态改变，初步探讨烧伤后胃肠动力障碍的发生机制及其临床意义。方法：健康、成年大白鼠70只，随机分为正常对照组10只，烫伤组60只。烫伤组动物按烫伤后1、3、6、12、24、48小时等不同时相点又分为6组，每组10只；烫伤组动物制备烫伤模型，所有动物在相应时间点处死后取结肠平滑肌组织，经急性酶分离法获得结肠带平滑肌细胞悬液，加FITC标记的抗体，结合平滑肌细胞内actin蛋白，用流式细胞仪检测平滑肌细胞内荧光强度。结果：实验中发现，烫伤后大鼠肠道平滑肌细胞骨架含量先明显升高，约1小时后逐渐降低，3小时后已明显低于正常值，并继续下降，大约6小时~12小时开始渐回升，在12小时~24小时达正常水平，但仍呈上升趋势，该趋势可延伸至48小时。结论：1．烫伤早期即可出现明显的肠道平滑肌细胞骨架含量的改变，这一变化过程体现了机体的修复与损伤力量抗衡的动态变化；2．推测肠道平滑肌细胞骨架的变化是导致烫伤后肠道平滑肌细胞动力功能出现异常，进而肠道功能发生紊乱、肠壁结构受到破坏的重要机制之一。

【关键词】烧/烫伤；肠道；平滑肌；细胞骨架/微丝；肌动蛋白/actin

【标识符】doi：10．3969/j．issn．1001-0726．2009．02．003

Semi-quantitative Study on the Effect of Scald on Cytoskeleton of Colonic Smooth Muscle Cells in Rats. TONG Ting-hui, WANG Chun-yan, GUO Li, et al. The Affilicated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou City, Sichuan Province, 64000, China.

【Abstract】Objective: To investigate the dynamical change of the content of cytoskeleton of colonic smooth muscle cells (SMCs) of scalded rat at the early stage so as to preliminary study the mechanism and clinical significance of gastrointestinal motility disorder after burn injury.  Methods: 70 adult and health rats were randomly divided into control group (10 rats ) and scald group (60 rats). The rats of scald group were divided into 6 groups (10 rats/group) according to the time points at 1sth, 3rdh, 6thh, 12thh, 24thh and 48thh after scale injury. The preparation of scald model was conducted in each scald group. All the rats were killed at the corresponding time point and then colonic smooth muscle tissue was taken. The cell suspension of colonic smooth muscle was obtained with acute enzyme separation, its fluorescence intensity within SMCs was detected by flow cytometry after FITC labeled antibody added into the suspension and combined with the actin binding protein. Results: The content of cytoskeleton of SMCs in scaled rats significantly went to high at first post-scald, then gradually reduced 1h later, significant lower than that of normal value observed 3h later, and continuous to decline, but about 6h~12h gradually turned around, up to normal level about 12h~24h, but then still kept upward trend, this trend can be extended to 48h post-scald.  Conclusion: 1. The content change of cytoskeleton of SMCs was observed obviously after scald injury at the early stage. This dynamical change reflects the antagonistic process of body’s repair and injury. 2. It may be an important mechanism, which the change of SMCs after scald injury resulted in abnormal dynamical functions of SMCs, that caused intestinal function disorder and structural damage to the intestinal wall. 

【Key Words】 Burn/Scald; Intestine; Smooth Muscle; Cytoskeleton/ Microfilament; Actin

目前普遍认为，烧伤后肠道细菌移位的出现与肠机械、生物学和免疫学三大屏障受损有关。根据我们长期的临床实践和前期研究结果推测，烧伤后胃肠动力障碍有可能也是导致细菌移位的机制之一。肠道平滑肌细胞是肠道动力的物质基础和源泉，对平滑肌细胞起支架作用的细胞骨架在维持肠道平滑肌细胞正常结构和功能中起着关键的作用，因此，本研究重点观察探讨肠道平滑肌细胞骨架在烧伤后是否会发生变化及其意义。

1．材料和方法

1．1．动物分组与实验方法

70只大鼠随机分组：①正常对照组(10只)：腹腔注射戊巴比妥钠30mg/Kg，背部剃毛但不烫伤；②烫伤组（60只）：麻醉后置背部剃毛区于92℃水浴18秒，造成7cm×10cm烫伤，立即腹腔注射乳酸钠林格氏液50ml/Kg复苏。烫伤组分别于伤后1、3、6、12、24、48小时等各时相点随机活杀10只。

动物处死后快速取结肠起始段5cm，清洗干净后在放大镜下分离平滑肌组织，剪成1mm×2mm大小，以混合酶液（胶原酶1g/L、胰蛋白酶抑制剂1g/L、牛血清白蛋白3g/L），37℃消化10分钟，再放入PBS(pH 7．2)液10ml中吹打，过滤，细胞悬液以70%酒精打孔后加FITC标记的抗大鼠肠道平滑肌细胞骨架微丝actin抗体，避光常温孵育30分钟，清洗、300目网过滤，调整细胞浓度为5×106/ml，流式细胞仪检测。

1．2．主要试剂

胶原酶Ⅱ（collagenase Ⅱ）：美国Sigma 公司生产；胰蛋白酶抑制剂，牛血清白蛋白：购自深圳晶美公司；异硫氰酸荧光素(FITC)标记的抗大鼠肠道平滑肌微丝肌动蛋白抗体(Actin-sc-7210 FITC)：美国Santa Cruz公司生产。

1．3．统计方法

所得实验数据为计量资料，采用SPSS 10．0软件进行统计。结果以平均数±标准差(X±S)表示。组间比较用独立样本t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2．结果

2．1．细胞荧光强度的变化

表1为各组10份样品细胞平均荧光强度值。各烫伤组分别与正常组相比，组间差异均有显著统计学意义；按时间顺序相邻两组依次比较其平均强度的差异，结果亦均具有显著性。

表1　各组平均细胞荧光强度值（x±s　n＝10）

注：与正常组比较，^*P<0．05，^**P<0．01；按时间顺序依次相邻两组比较，^▲P<0．05，^▲▲P<0．01。

2．2．细胞荧光动态变化

图1为各组平均细胞荧光强度值曲线图，显示了烫伤后肠道平滑肌细胞中细胞骨架含量的动态变化。可以看出：烫伤后大鼠肠道平滑肌细胞骨架含量先明显升高，约1小时后降低，3小时后已明显低于正常值，大约6小时~12小时开始渐回升，约在12小时~24小时间达正常水平，但仍呈上升趋势，并持续至48小时。

图1　烫伤后肠道平滑肌细胞中

细胞骨架含量的动态变化

3．讨论

3．1．细胞骨架的结构及其在细胞中的功能

细胞骨架（cytoskeleton， CSL）是指真核细胞中的蛋白纤维网络结构，它与外侧的细胞膜和内侧的核膜存在一定的结构联系。细胞骨架由微丝（microfilament，MF）、微管（microtubule，MT）和中间纤维（intemediate filament，IF）组成。它们均由单体蛋白以较弱的非共价键结合在一起，构成纤维型多聚体，很容易进行组装和去组装，这正是实现其功能所必需的特点。本实验中检测的肌动蛋白(actin)是微丝的主要组成成分，微丝又称肌动蛋白纤维（actin filament）。

细胞骨架构成了细胞的支持结构和胞质其它成分的依附支架，以此维持细胞的特定形状和细胞内多种成分的空间位置，对细胞的稳定性起重要作用。细胞骨架在细胞运动、有丝分裂、信息传递、能量转换、代谢调控以及纤维细胞形态方面具有重要作用[1~3]。可见，细胞骨架结构的改变将导致细胞许多功能的改变。

在肌细胞中，细胞骨架参与构成肌原纤维，组成了动力系统，执行着肌细胞收缩的功能；还与细胞膜一起共同协调细胞间的代谢和功能耦合（如保持细胞间的紧密连接）[4]。我们推测肠道平滑肌细胞骨架损伤，可能在多方面影响该细胞的生物学特性，成为严重烧伤后肠平滑肌损害、肠道细菌移位中一个不可忽视的病理生理机制。

3．2．烫伤后细胞骨架的变化趋势和意义

烫伤早期即可出现肠道平滑肌细胞骨架的破坏，该损伤呈持续加重的趋势，直到大约6小时~12小时后才趋于平稳，转为修复性表现；约至48小时细胞骨架蛋白合成功能依然活跃。宋力等[5]以大鼠烧伤血清作用于人脐静脉内皮细胞骨架的研究，也得到了类似结果。本实验观察到的结果体现了损伤和修复力量抗衡的动态过程。

（1）actin荧光强度在烫伤后1小时内升高，推测可能的原因有：①应激反应启动了细胞的合成功能，蛋白合成增多，骨架蛋白actin含量增加；②大量骨架蛋白解聚，原来被遮蔽的部分actin暴露出来，与抗体结合，表现为荧光强度增高。

（2）荧光强度在烫伤后1小时~6小时明显减少，可能的原因有：①蛋白合成所需原料供不应求，actin的组装将减慢；②合成能力已发挥到极限的时候，合成的速度也将不再升高，而此阶段损伤在继续加重，actin的降解超过合成，也表现为荧光强度的相对减少。这说明打击对机体的损伤在持续存在。

（3）烫伤后12小时开始到48小时，该段曲线呈明显上升趋势，推测此时蛋白质又开始大量合成以修复损伤；在烫伤后48小时已远远超过正常细胞，符合机体修复的“矫枉过正” 现象。在有丝分裂的过程中，不同分裂期细胞内骨架含量不同，悬殊很大。我们在分离细胞时光镜下亦见到有丝分裂期细胞。推测上述荧光强度（骨架含量）的增加反映了机体修复功能的活跃。

3．3．烫伤后细胞骨架损伤可能的机制

严重烧伤后机体会出现一系列反应，而这些反应均可引起肠道平滑肌细胞的损伤，其可能的机制是：①烧伤时的应激反应，使内脏供血减少^[6]；②血液流变学改变，血液粘稠，导致肠道微循环障碍，组织细胞出现严重的代谢障碍，肌细胞水肿，肌纤维收缩^[7]；细胞内钙积聚，肌纤维痉挛收缩，导致细胞骨架断裂^[8~9]；③氧自由基释放和再灌注损伤则进一步加重了组织损伤；④内毒素（LPS）及激活的细胞因子和炎性介质的吸收，可引起组织水肿和破坏。有研究表明，胃肠道是烧伤早期受LPS攻击最早、损害最重的器官之一^[10]；⑤能量饥饿耗竭：烧伤本身就是高代谢（应激和创面），再加上主、被动禁食等因素，即可导致机体能量供应不足，细胞骨架正常结构的维持与细胞内ATP水平相关，能量耗竭，骨架蛋白磷酸化，抑制骨架蛋白聚集、装配，导致骨架解聚^[11]。

3．4．平滑肌损伤给机体带来的影响及对临床的启示

肌动蛋白的主要功能是为微丝提供动力，微丝又参与构成平滑肌细胞的支架和动力系统，其改变必然导致平滑肌细胞的功能和结构受到影响，意味着肠道动力系统发生异常。结合我们前期的研究结果，如烧伤后肠道平滑肌细胞膜电位改变，线粒体破坏，K⁺-Na⁺-ATP酶等含量下降，提示烧伤后肠道平滑肌细胞能量供应障碍及其他方面损伤的存在。

3．4．1．肠动力功能障碍的后果：

（1）消化吸收受影响：烧伤创面和应激反应等使机体代谢成倍增加，耗能大幅度提高，消化吸收功能的减弱使能量不足矛盾更加突出。

（2）形成死腔，毒素积存、吸收：严重烧伤后肠蠕动功能减弱，肠内容物通过时间过长，致使细菌过量繁殖、移位和大量内毒素吸收，吸收入血的毒素进一步损伤肠平滑肌，可导致中毒性肠麻痹，进入恶性循环。

（3）渗出增加，体液丢失：创面的渗出是严重烧伤的主要矛盾之一，肠腔内的渗出和体液留存更加重了机体的水、电解质紊乱。

3．4．2．肠壁结构受损：肠壁结构的完整与否与肠源性内毒素血症和细菌移位的发生有着密切的联系。肠道平滑肌的损伤则直接导致肠道屏障功能的破坏，依附其上的黏膜的完整性受到威胁；同时，肠壁通透性增大^[12~13]，都为肠道细菌移位的发生提供了条件。

目前已知肠道屏障损伤和破坏是发生肠源性内毒素血症和细菌移位的重要原因，肠源性内毒素血症激活机体炎症细胞因子连锁反应和毒性网络进而破坏肠—肝—肺轴功能是引起多器官衰竭的重要途径，肠道细菌微生态失衡是肠源性内毒素血症和细菌移位发生的重要因素之一。而肠道平滑肌的损伤则直接导致并加重了胃肠功能紊乱，破坏了肠道屏障功能和动力系统，为肠道细菌移位的发生提供了条件，加速了全身情况的恶化，并可能作为肠道细菌移位的发生机制之一参与了肠道细菌移位的发生、发展和转归的全过程。所以，应尽早恢复胃肠道的运动和功能，以促进肠道平滑肌的保护和修复。陈德昌等^[14]也认为胃肠动力学的恢复是缓解胃肠功能衰竭最初和最关键的途径。

综上所述，烫伤早期即可出现肠道平滑肌细胞骨架的改变，损伤导致细胞骨架含量的一过性增高以后持续性减少，直到大约6小时~12小时后，损伤逐步减轻，修复功能逐渐加强，到约48小时，骨架蛋白的含量明显高于对照组，提示细胞修复功能持续活跃。这一变化过程体现了机体的修复与损伤力量抗衡的动态变化。烫伤后肠道平滑肌细胞骨架的变化导致肠道平滑肌细胞功能出现异常，肠道功能障碍可能参与了肠道细菌移位的发生、发展，提示临床应尽早保护机体的自我修复能力，减轻损伤的严重后果^[15]。

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