赵冬梅，黄 飞，胡凤爱，刘洪付，于振海，张璐萍
滨州医学院人体解剖学教研室，山东 滨州 256603
【摘要】目的：观察湿润烧伤膏（MEBO）联合表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）对兔膝关节局部全层软骨缺损的修复作用。方法：30只新西兰大白兔，制成兔膝关节软骨缺损创面。按治疗方法不同随机分为三组，A组：MEBO+EGF组，B组：EGF组，C组：庆大霉素对照组。分别于术后4、8和12周每组各处死3只动物，取材进行大体、组织学及免疫组化染色观察，根据关节软骨组织学计分标准进行评分，数据输入SPSS11.0软件统计分析，比较各组的评分差异是否具有统计学意义。结果：MEBO+EGF组为透明软骨样修复，而单纯EGF组和对照组为纤维性修复；对术后12周大体及各阶段组织学形态评分结果示，MEBO+EGF组明显优于EGF组和对照组（P<0.05）；EGF组优于对照组（P<0.05）。结论：MEBO联合EGF对兔膝关节全层软骨缺损有修复作用。
【关键词】湿润烧伤膏（MEBO）；表皮细胞生长因子；骨外露；软骨缺损
【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2010.02.022
Experimental Study on Repairing Cartilage Defects in Keen Joint of Rabbit with MEBO Plus Epidermal Growth Factor. ZHAO Dong-mei，HUANG Fei，HU Feng-ai，et al.Department of Anatomy，Binzhou Medical University，Binzhou，Shandong Province 256603，China.
【Abstract】Objective：To study the curative effects of MEBO combining with epidermal growth factor（EGF）on the full thickness cartilage defects in keen joint of rabbit.Methods：Thirty healthy New Zealand rabbits were divided into three groups randomly，10 rabbits of each group，i.e.group A（MEBO and EGF group），group B（EGF group） and group C（Gentamicin group）.Three rabbits of each group were killed at 4，8 and 12 weeks respectively after the operation.Then the samples were observed by naked eye，histological and immunohistochemical method.The observed results were scored in accordance with judging standard of histology of articular cartilage.The scored data then were imported into statistic software of SPSS 11.0 for statistic processing.The results obtained in statistic processing were compared.Results：The defects in group A was repaired as hyline-like tissue，but the other groups were repaired as fibrous tissue.The scored morphology results obtained from naked eye observation at the time point of 12 weeks of post-operation and histology observation at each sampling stage showed that the scores of group A were significant better than that of group B and group C（P<0.05），and the scores of group B were superior to that of group C（P<0.05）.Conclusion：MEBO combining with EGF has effect to repair full-thickness cartilage defects in keen jiont of rabbit.
【Key words】MEBO；Epidermal growth factor；Bone exposure；Cartilage defects
软骨缺损的修复长期以来一直是临床上所面临的难题，随着老龄化社会的到来，骨性关节炎（OA）已变得越来越普遍，成为社会的严重负担。关节软骨为特殊的无血管性组织，细胞成分单一为软骨细胞，而软骨细胞为中末分化细胞，在体内基本不通过有丝分裂而增殖，所以软骨损伤很难自我修复。我们应用湿润烧伤膏（MEBO）联合表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）对兔膝关节局部全层软骨缺损进行修复，旨在为临床上提供一种由各种创伤所致的软骨缺损的治疗方法。
1.材料与方法
1.1.实验材料：
1.1.1.实验药物：湿润烧伤膏（MEBO）由汕头市美宝制药有限公司生产。EGF溶液（喷雾型，2000 U/ml，15 ml/支），由深圳华生元基因工程发展有限公司生产。鼠抗兔Ⅱ型胶原单克隆抗体（Oncogene公司），二步法免疫组化染色试剂盒（福州迈新公司），胰酶试剂盒（福州迈新公司），DAB显色试剂盒（福州迈新公司），甲苯胺蓝染料、苏木素-伊红染料（本院病理科提供）。
1.1.2.实验动物及模型制作：新西兰大耳兔30只，雌雄不拘，体重2.1kg~3.5kg，由山东大学实验动物中心提供。动物仰卧于手术台上，四肢固定，双侧膝关节碘伏消毒，2%利多卡因局部浸润麻醉。取膝关节内侧弧形切口，髌骨翻向外侧，暴露股骨内髁负重区及滑车软骨面，用直径5mm的圆形钻头钻孔深3mm，当钻透软骨下骨略有阻力感时，即停止继续钻入，可见有新鲜血液溢出，制成关节全层软骨缺损模型。
1.2.实验方法：实验分组随机分为3组，每组10只动物。A处理组植入MEBO/EGF：涂MEBO，涂药1次/4小时～6小时，涂药厚度为1mm 左右，待有肉芽组织长出时EGF均匀喷洒创面，每次涂药时重复以上操作；B处理组单纯应用EGF喷洒创面；C处理组外用含庆大霉素的油纱敷于创面，再用无菌纱布覆盖，换药1次/天。术后不限制活动，标准饲料单笼饲养。第4、8和12周各处死3只动物，取双膝关节做大体、组织学及免疫组化观察。
1.3.免疫组化二步法染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（pH7.4）冲洗3次，每次3分钟；（2）除去PBS液，每张切片加50μl的3%H2O2在室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗3次，每次3分钟；（3）除去PBS液，于试管中加入一滴胰酶浓缩剂和三滴稀释剂，混匀后在组织切片上滴加2滴混匀酶，以修复抗原，37℃孵育15分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；（4）除去PBS液，滴加2滴或100μl 10%正常山羊血清封闭液，室温下孵育15分钟，减少非特异性背景，甩去多余液体，不洗；（5）每张切片滴加50μl适当稀释（1∶50）的第一抗体（Ⅱ型胶原单克隆抗体），37℃孵育1小时~2小时或40℃过夜，进行抗原抗体特异结合，PBS冲洗3次，每次3分钟；（6）除去PBS液，每张切片加50μl的多聚鳌合物，室温下孵育30分钟，PBS冲洗3次，每次3分钟；（7）除去PBS液，每张切片加50μl新鲜配制的DAB溶液显色，显微镜下观察3分钟~5分钟，自来水充分冲洗，苏木素轻度复染，中性树胶封固。
1.4．统计学处理：将标本常规固定、EDTA脱钙、包埋、切片、甲苯胺蓝染色和HE染色，进行组织学观察，并采用盲法对各标本进行组织学评分，评分标准采用Wakitanifa法[1]，所得半定量资料采用单因素方差分析进行显著性检验。
2.结果
2.1．大体观察：所有动物膝关节活动正常，关节腔无明显粘连，关节液清亮，缺损区周围软骨无磨损及骨赘形成。A组：4周缺损已由半透明组织填充；8周修复组织外观与正常软骨相似，边界模糊，表面光滑；12周与周围软骨色泽相近，表面光整（图1）。B组：4~8周缺损区修复组织表面欠光整，部分仍呈空洞，12周为虫蚀样改变，色泽浅黄（图2）。C组：4~8周为纤维样组织覆盖，仍有较大的空洞，12周为纤维样修复，仍有空洞（图3）。
2.2．组织学观察：A组：4周细胞数目较少，表层细胞呈梭形，深层细胞呈圆形或椭圆形，可见软骨陷窝；8周修复组织周围软骨大部分结合，细胞数目较多，以圆形透明软骨样细胞为主，有软骨陷窝，表层有梭形成纤维样细胞；12周修复组织为透明软骨样，厚度接近正常，与周围软骨结合好，表层有梭形成纤维样细胞，有软骨陷窝，深层软骨钙化，与底层骨结合紧密（图4）。甲苯胺蓝染色（图5）与周围正常组织无明显差别。B组：4~8周细胞数目较少，细胞层次排列差。12周修复组织厚度接近正常，呈纤维软骨样（图6），甲苯胺蓝染色减少。C组：4~8周缺损组织由薄层纤维组织覆盖，12周缺损区纤维组织进一步增厚，与周围软骨未结合（图7），甲苯胺蓝染色不明显。
2.3．关节软骨组织学半定量评分结果：对15只新西兰大白兔（60膝）按Wakitanifa法进行关节软骨缺损修复区的组织学半定量评分，对各组各阶段的平均分进行统计学分析，采用单因素方差分析（见表1）。结果表明，实验组A、B、C三组在各阶段两两比较的软骨组织学半定量评分均有统计学意义（P<0.05）。
表1 修复软骨的组织学评分（x±s）
|
组别 |
缺损区数 |
术后4周 |
术后8周 |
术后12周 |
|
A |
20 |
5.17±1.115 |
1.83±0.835 |
0.42±0.515 |
|
B |
20 |
8.50±1.679 |
6.92±1.240 |
5.83±1.193 |
|
C |
20 |
11.50±1.314 |
9.00±1.128 |
7.08±0.996 |
注：P<0.05
2.4．免疫组化染色：A组修复组织中细胞质和细胞外基质中Ⅱ型胶原的表达强阳性，Ⅱ型胶原染色出现棕黄色颗粒，B组表达弱阳性，C组无Ⅱ型胶原表达，见图8、图9。
2.5．疗效评价：对术后12周4只动物（16膝）关节软骨缺损修复区进行疗效评价，结果如表2所示，采用秩和检验可知：12周时的修复效果A组与B、C组均有显著差异（P<0.01）。
表2 12周修复组织疗效评分
|
组别 |
完全修复 |
不完全修复 |
未修复 |
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A |
16 |
0 |
0 |
|
B |
0 |
4 |
12 |
|
C |
0 |
0 |
16 |
注：A组与B、C组对照：P<0.01
3.讨论
创伤后组织修复过程从凝血开始，由许多细胞相互协作共同参与完成。最初血小板、中性粒细胞和巨噬细胞大量进入创伤区，清除受损组织和污染的微生物，其中血小板和巨噬细胞还分泌一些与成纤维细胞和内皮细胞生长有关的生长因子，接着成纤维细胞和内皮细胞逐渐取代受损基质，同时上皮细胞也从创缘向内生长，直至覆盖伤口[2]。因此创伤修复的快慢取决于上述细胞进入伤口并增生的速度，而细胞的进入和增生又依赖于趋化因子和生长因子的参与。趋化因子通常是肽类、蛋白质和蛋白质片断，它可引起细胞向一定方向移动；生长因子也是蛋白质和肽类，与其靶细胞膜表面的相应受体结合后，诱导细胞DNA的合成和分裂。正常软骨细胞的表型表达，是关节软骨基质保持稳定和保证其正常生理、生化及力学特性的基本条件[3]。研究表明，软骨中最丰富的基质是胶原蛋白，关节软骨至少含有5种不同形态的胶原，其中，Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型是软骨所特有的，3种胶原相互交联，组成胶原纤维网络，而透明软骨中Ⅱ型胶原含量最高，占胶原蛋白90%以上。Ⅱ型胶原在关节软骨中是主要的胶原成分，是软骨保持结构紧密性和生物力学特性的基本条件[4]，由于软骨基质中含有丰富的Ⅱ型胶原，Ⅱ型胶原的合成与分泌可作为软骨细胞维持其分化表型的特定指标，其在组织工程化软骨的含量已成为评价其质量必不可少的重要指标。
皮肤培养基MEBO为骨裸露创面提供湿润的生理环境，促进表皮干细胞原位培植，为皮肤的再生修复提供生物化学基础。创面愈合的基本过程大致分为三个阶段：炎症反应期、肉芽组织形成期和新生组织改建期。MEBO是一种天然的、平衡的、全营养皮肤培养基，在干细胞原位培植皮肤器官的过程中起重要作用。它含糖、脂肪、氨基酸、微量元素等营养成分，给皮肤再生修复提供物质保障。MEBO剂型是内嵌油滴式框架结构，不含水分，具有呼吸功能，这样就使皮肤瘀滞组织处于湿润环境中，既隔离空气等外界因素对创面的再损伤，又能减少创面水分的蒸发，其特点能保持骨与肌腱裸露创面湿润，促进打孔骨组织肉芽生长，避免创面发生再干枯坏死。MEBO仅19μm的小巢型结构可防止细菌侵袭和寄宿，自动无创的液化引流能及时清除细菌，这些特点能全方位预防和控制创面感染。创面炎症越轻，越能发挥创面内外源生长因子的最佳效能，使内外源性的EGF进一步促进创面肉芽组织生长。MEBO成分之一——β-谷甾醇，可能是表皮干细胞再生的激活物，可将皮肤19型角蛋白的细胞原位激活，使皮肤原位培植表皮干细胞成为可能[5]；MEBO能改善创面微循环，加速创面新陈代谢，促进巨噬细胞的游出、聚集于创面。巨噬细胞一方面作为抗炎的主要细胞，负责清除损伤的细胞和病原体，另一方面还主动调动内源性生长因子。总之，MEBO通过水解、酶解、皂化和酸败这四大生物化学反应，保障创面供养，维持创面代谢[6]。MEBO保持创面湿润环境，主动调动组织内源性生长因子，使裸露骨与肌腱创面的皮肤干细胞原位培植，为皮肤再生创造了条件。
Cohen（1962）发现，EGF与细胞膜上受体结合可激活多种酶，对炎性细胞、成纤维细胞、表皮细胞及血管内皮细胞有趋化作用，促进DNA、RNA和羟脯氨酸的合成，调节蛋白质合成，完善胶原蛋白的构建，加快创面愈合速度，已被基础和临床研究所证实[7~8]。EGF在加快上皮细胞生长的同时可提高创面的抗张强度，改善创面的愈合质量[9]。但骨外露创面由于伤口内软组织床少，表皮细胞生长因子受体少，如我们实验C组修复软组织学评分较A、B组明显高，故单独应用EGF促进该类创面愈合的效果不理想。Brem等[10]应用含有EGF的人工皮片移植治疗糖尿病足及褥疮等慢性难愈伤口，发现无骨外露的伤口移植的人工皮片成活，而在骨外露伤口移植的人工皮片坏死，伤口不能愈合，表明EGF对骨外露创面的愈合作用较小。
湿润烧伤膏具有活血化瘀、抗炎杀菌、祛腐生肌作用，可能具有趋化巨噬细胞，刺激成纤维细胞和血管内皮细胞增殖的能力，可明显促进肉芽组织的增生，有利于创面的愈合。在骨外露创面应用MEBO和外源性EGF后，关节软骨创面修复明显好转。因此临床治疗骨外露创面时，可先应用MEBO生肌中药，调动体内炎性细胞及各种生长因子，促进肉芽组织生长，将外露的骨质覆盖，然后改用外源性EGF，促进上皮增生，至伤口愈合。
参考文献
[1]Wakitani S，Goto T，Pineda SJ，et al. Mesenchymal cell-based repair of large，full-thickness defects of articular cartilage and underlying bone [J]. J Bone Joint Surg（Am），1994，76（4）：579~592.
[2]付小兵，王德文.现代创伤修复学[M].北京：人民卫生出版社，1999：223.
[3]Helen M.The chondrocyte，architect of cartilage[J].Bio Essays，1995，17：1039.
[4]Pullig O，Kladny B，Weseloh G，et al.Metabolic activation of chondrocytes in human osteroarthritis. Expression of type Ⅱ collagen[J].Z Orthop Ihre Grenzgeb，1999，137（1）：67.
[5]徐荣祥.大面积深度烧伤原位干细胞皮肤培植技术及系统治疗[J].中国烧伤创疡杂志，2001，13（1）：20.
[6]张郑，张汝敏，李亮.湿润烧伤膏结合bFGF治疗骨与肌腱外露创面[J].实用医药杂志，2007，24（6）：653~654.
[7]Inoue M，Ono I，Tateshita T，et al. Effect of a collagen matrix containing epidermal growth facto r on wound contraction[J]. Wound Repair Regen，1998，6（3）：213~222.
[8]Mills BG，F rausto A，Brien E. Cytokines associated with the pathophysiology of aggressive fibromatosis[J]. J Orthop Res，2000，18（4）：655~662.
[9]廖毅，郭力，丁尔英，等.重组人表皮细胞生长因子治疗烧伤创面研究[J].中国修复重建外科杂志，2003，17（4）：301~302.
[10]Brem H，Balledux J，Bloom T，et al. Healing of diabetic foot ulcers and pressure ulcers with human skin equivalent：a new paradigm in wound healing[J]. Arch Surg，2000，135（6）：627~634.
【作者简介】
赵冬梅（1976~），女（汉族），山东滕州人，2000年毕业于滨州医学院，讲师，教研室副主任.
黄 飞（1971~），男（汉族），山东菏泽人，2006年毕业于山东大学，博士，教授，教研室主任.
胡凤爱（1978~），女（汉族），山东莱芜人，2001毕业于滨州医学院，讲师.
