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刘　斌，刘伟峰，姜任武，唐　江

湖南湘潭市中心医院，湖南　湘潭　411100

 

【摘要】目的：研究抑癌基因PTEN（第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因）和血管内皮生长因子（VEGF）在病理性瘢痕中的表达及其相关性。方法：应用免疫组化SP法检测正常皮肤、扁平瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中PTEN、VEGF蛋白的表达并进行统计学分析。结果：病理性瘢痕组织中PTEN蛋白表达显著低于正常皮肤、扁平瘢痕（P<0.05）；病理性瘢痕组织中VEGF蛋白表达增高，与正常皮肤、扁平瘢痕对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）；四类组织中PTEN蛋白和VEGF蛋白呈负相关（P<0.05）。结论：VEGF及PTEN是病理性瘢痕发生发展中重要的调控因子，PTEN在病理性瘢痕中表达的下降可能导致VEGF的上升，从而导致病理性瘢痕的形成。

【关键词】增生性瘢痕；瘢痕疙瘩；PTEN；血管内皮生长因子（VEGF）

【标识符】doi：10.3969/j.issn.1001-0726.2010.03.020

 

【Abstract】 Objective：To study the Expression and correlation of PTEN（cancer suppressor gene） and VEGF in pathological scar.Methods：Expression of PTEN and VEGF in the normal skin，flat scar，hypertrophic scar and keloid was determined by Immunohistochemistry with SP method and analyzed with statistics processing.Results：Compared to normal skin and flat scar，expression level of PTEN was significantly lower that in pathological scar（P<0.05）.Expression of VEGF protein in pathological scar increased，compared to that in normal skin and flat scar，it had statistically differences（P<0.05）.There was negative correlation between PTEN protein and VEGF protein in four kinds of tissue（P<0.05）.Conclusion：VEGF and PTEN are all important regulatory factors in the occurrence and development of pathological tissue.The decrease of expression of PTEN in the pathological scar may cause the increase of VEGF，which results in the formation of pathological scar.

【Key words】Hypertrophic scar；Keloid；PTEN；VEGF

 

增生性瘢痕与瘢痕疙瘩是烧、创伤或病损后组织过度修复的表现，其形成机理尚不完全清楚。在分析病理性瘢痕发生机制的诸多因素中，血管因素受到人们越来越多的关注。特别是近年来，人们从抑制血液供应旺盛的肿瘤血管获得抑制肿瘤生长的效果中得到启示后，认为血液供应丰富也是具有“肿瘤样增殖倾向”的病理性瘢痕发生的最初诱因。进而像对待肿瘤那样，通过抑制血管的生成阻止病理性瘢痕发生的资料日渐增多，抑癌基因PTEN（第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因）是近年来肿瘤研究的一个热点。血管内皮生长因子（vascular endot helial growth factor，VEGF）是目前发现的作用最强的促血管生成细胞生长因子^[1]，在血管形成、促进创伤愈合与组织修复、促进组织再生方面起着十分重要的作用。我们应用免疫组化方法，检测了增生性瘢痕、瘢痕疙瘩组织中PTEN、VEGF蛋白的表达情况，并与扁平瘢痕、正常皮肤作了比较，初步探讨PTEN、VEGF与病理性瘢痕形成的关系，为瘢痕的防治提供一定的实验依据。

 

所有标本均来自湖南湘潭市中心医院2002年5月至2008年12月采集的手术切除组织，共97例，并均获得患者知情同意。瘢痕疙瘩标本17例，其中男性10例，女性7例，年龄4岁～37岁，部位：胸骨前4例，面颈肩部3例，耳垂部4例，肩背部3例，足部2例，腹部1例。增生性瘢痕34例，男18例，女16例，年龄2岁～47岁，其中四肢24例，面颈部10例，术前均未做化疗和放疗，1年内无局部注射药物、外用药物，瘢痕局部无治疗。正常皮肤24例，年龄14岁～47岁，取材于面部整形美容手术时去掉的多余皮肤16例，以及平时植皮取皮时多余的皮肤8例，其中女18例，男6例。另外取扁平瘢痕组织22例，年龄5岁～45岁，瘢痕病程均为一年以上，男13例，女9例。标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm厚连续切片，贴于涂有0.05%多聚赖氨酸的载玻片上备用。

鼠抗人PTEN单克隆抗体（工作浓度1∶50稀释），购自北京中杉金桥生物技术有限公司；兔抗人VEGF多克隆抗体（工作浓度1∶50稀释），SP免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒，PBS缓冲液，以上均购自武汉博士德生物工程有限公司。

标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片，作SP法免疫组化染色。用已知的上述抗体染色阳性的组织作阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。SP法参照试剂盒的说明进行。

严格按照吕宏升等提出的免疫组化定量分析图像采集方法的要求^[2]，参考kraan等免疫组化定量分析方法^[3]，采用专业图像分析软件Image-Pro Plus 6.0进行处理。分别挑选高倍镜视野下的表皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞黄染区域作为测量区域（AOI），测得切片上DAB显色为棕黄色代表阳性区域的光密度值，每张切片分别随机选取10个视野，测量光密度，取其平均值，作为平均光密度值（mean optical density MOD），并以此代表实验所研究蛋白的表达强度进行分析。

本实验数据均为计量资料表示，统计分析采用SPSS13.0统计软件包。统计数据均采用均数±标准差（x(_)±s）表示。计量资料在进行方差齐性和正态分布检验后，采用单因素方差分析、LSD-t检验、和Pearson直线相关分析，P<0.05为差异有显著意义。

 

2.1.1.PTEN阳性染色为棕黄色，表达于表皮细胞，内皮细胞及成纤维细胞的胞质内，PTEN在扁平瘢痕和正常皮肤中表达最强（见图3，4），明显高于瘢痕疙瘩和增生性瘢痕（见图1，2）（P<0.05）。扁平瘢痕和正常皮肤之间相比无统计学意义（P>0.05）。

2.1.2.瘢痕疙瘩和增生性瘢痕亦有少量表达，两者相比无统计学意义（P>0.05）。

2.2.1.VEGF阳性染色为棕黄色，表达于细胞质内和细胞核内，胞质表达较多。表皮细胞、内皮细胞及成纤维细胞均有表达，在瘢痕疙瘩和增生性瘢痕表达最强（见图5，6），明显高于扁平瘢痕和正常皮肤（见图7，8）（P<0.05），且在瘢痕疙瘩与增生性瘢痕两者之间的表达没有统计学意义（P>0.05）。

2.2.2.VEGF在扁平瘢痕和正常皮肤亦有少量表达，但是两者差异没有统计学意义（P>0.05）。

表1四类组织中PTEN及VEGF表达的平均光密度

表2LSD-t法检验四类组织中PTEN的表达差异的P值

表3LSD-t法检验四类组织中VEGF的表达差异的P值

　　VEGF是目前已知最重要的促血管生成因子之一，VEGF是一种高度特异性血管内皮细胞有丝分裂素，具有双重功能：（1）可增加微血管通透性，促进血浆纤维蛋白外渗，为血管形成中多种细胞迁移提供一个纤维网络；（2）通过与内皮细胞上两个特殊受体flt和flk/KDR结合，直接刺激内皮细胞的分裂、游走和增殖，从而促进血管形成。在正常生理状态下，VEGF的表达很低，但受缺氧、低血糖及多种生长因子的调节，其表达会明显增高^[4]。笔者的研究结果显示，VEGF在瘢痕疙瘩中及增生性瘢痕中呈高表达，而在正常皮肤及扁平瘢痕中呈低表达，两者之间差异性显著，提示VEGF在病理性瘢痕的发展中起重要作用。我们认为：烧、创伤组织修复过程中，当局部微环境发生变化，如持续低氧、严重感染、组织长期的高代谢反应以及异物的存留均可以使皮肤角质细胞、成纤维细胞分泌的促血管生长因子增多；同时内皮细胞对促血管生成因子的反应提高，从而使新生血管异常增多^[5]。新生的血管可为成纤维细胞合成胶原提供丰富的前体物质，而胶原的大量合成和沉积又压迫微血管使得局部氧浓度更低，进一步引起血管的增生^[5]，形成恶性循环，这可能是瘢痕增生发生发展的病理机制之一。

　　1997年Li等^[6]在人类染色体10q23特定区域发现肿瘤抑制基因——第10号染色体丢失的张力蛋白同源的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10，PTEN），PTEN编码具有脂质磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的双重特异性磷酸酶，PTEN通过以下机制抑制肿瘤的形成和发展，即① 通过使FAK去磷酸化，抑制细胞转移及浸润；② 通过使PIP3去磷酸化，达到阻止细胞生长及促进细胞凋亡的目的；③通过抑制MAPK信号转导通路抑制细胞生长分化；④ PTEN下调VEGF mRNA的水平可以影响其分泌，从而调控血管生长^[7]，进而影响肿瘤的生长和转移；⑤ 通过调控依赖磷酸肌醇信号途径而控制肿瘤介导的血管生成和恶性转变，从而调控肿瘤发生^[8]。笔者的研究结果显示，PTEN在瘢痕疙瘩及增生性瘢痕中呈低表达，而在正常皮肤及扁平瘢痕中呈高表达，两者之间差异性显著。据此推测PTEN蛋白表达可能是组织创伤后正常修复的必要因素之一，而在某些病理状况下，组织修复时PTEN蛋白表达下降，从而细胞周期的调节失控，导致瘢痕修复时成纤维细胞、内皮细胞等生长失控，血管增生紊乱，细胞外胶原沉积，从而导致了病理性瘢痕的形成。在四类组织中，PTEN与VEGF存在着负相关，相关系数为-0.718，而国内江新^[9]等研究骨肉瘤时发现PTEN与VEGF存在着负相关；张韶峰^[10]等研究胃癌时发现PTEN与VEGF存在着负相关，而在病理性瘢痕中两者存在怎样的关系？研究发现，PTEN蛋白表达降低或缺失时失去对PI3K/Akt途径的下调作用，被氧化灭活片断的聚集有利于磷脂酰3，4，5-三磷酸盐质膜的形成，导致AKt的活性增强和对它的下游靶位的调节，同时PTEN表达的缺失能增加PI3K的活性而增强PI3K信号^[11～13]，增强了HIF-1对VEGF的诱导，从而促进了VEGF的表达，促进血管内皮细胞增殖和肿瘤微血管的形成，使肿瘤细胞的侵袭转移能力增高^[14]。根据以上推断，在病理性瘢痕中，PTEN的表达减少降低了对PI3K/Akt途径的下调作用，从而导致了VEGF的升高，致使病理性瘢痕的形成。但病理性瘢痕中PTEN如何调控VEGF表达仍需进一步研究和证实。本实验中，两者的相关系数为-0.718，单纯从统计学意义上来说，不属于强相关，提示vegf的升高除了受PTEN的表达降低影响外，还有其它很多方面的因素。

综上所述，VEGF和PTEN是病理性瘢痕发生发展中重要的调控因子，PTEN在病理性瘢痕中表达降低可能促进了VEGF的升高，从而引起血管增生而导致病理性瘢痕的形成。本实验为瘢痕的靶向治疗和生物治疗提供了一定的理论依据，但它们之间的相互作用受多方面因素的调节，而且其参与的调控信号途径的具体机制尚不清楚，还需进一步的研究。

 

参考文献

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【作者简介】

刘　斌（1967～），男（汉族），湖南湘潭人，2003年毕业于华中科技大学同济医学院，硕士，烧伤创疡整形科主任，中南大学湘雅医学院兼职副教授.

刘伟峰（1982～），男（汉族），湖南冷水江市人，2009年毕业于中南大学湘雅医学院，硕士，烧伤创疡整形科医师（通讯作者）.