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烧伤血清诱导RAW264.7细胞
分泌TNF-α的规律

尹朝奇，罗成群，贺全勇，周建大，
朱 颉，李 萍，彭 浩，陈铁夫  

【作者单位】 中南大学湘雅三医院烧伤整形科，湖南 长沙 410013  【摘 要】 目的：探讨烧伤血清诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌TNF-a的规律及其在脓毒症中的作用。方法：烧伤血清的剂量效应组分别用含有0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养6h，用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF-a含量，采用流式细胞技术观察细胞的凋亡。烧伤血清的时间效应组以含有2.5ml烧伤血清的培养基，对照组以不含烧伤血清的培养基，另外以含有2.5ml烧伤血清和100mg/L LPS的混合组的培养基分别培养RAW264.7细胞0，2，4，6，8，10，12，24h，同上留取离心后的培养液上清，用双抗体夹心ELISA法测其上清中的TNF-a含量。结果：将烧伤血清加入到小鼠单核巨噬细胞RAW264.7培养液中能明显刺激TNF-a的分泌。在0.5ml～2.5ml范围内，烧伤血清诱导RAW264.7细胞的TNF-a分泌增加，呈显著的剂量依赖性关系，2.5ml烧伤血清能明显诱导RAW264.7细胞的凋亡；烧伤血清组和烧伤血清与LPS的混合组RAW264.7细胞的TNF-a分泌在0～24h间呈双相性规律。结论：烧伤血清能诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7的TNF-a分泌与凋亡，初步证实烧伤血清在脓毒症的发生、发展中发挥重要作用。
     【关键词】 烧伤血清；单核巨噬细胞；肿瘤坏死因子；脓毒症
     【中图分类号】R644.03；R349.21 【文献标识码】A 【文章编号】1001-0726（2007）02-0103-04

Dynamics of TNF-α secretion from RAW264.7 cells induced by burn serum YIN Chao-qi, LUO Cheng-qun, HE Quan-yong, et al. The Dept. of Burns and Plastic Surgery, The 3rd Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province 410011,China
     【Abstract】 Objective: To explore the dynamics of the secretion of TNF-α from RAW264.7 cells induced by burn serum and its effect on sepsis in mice.Method: To observe the effect of the dose of the serum on the secretion of TNF-α, RAW264.7 cells were cultivated with respectively 0.5, 0.1, 1.5, 2.0 and 2.5 ml of burned serum for 6 hours. TNF-α content was determined by ELISA method. Cell apoptosis was observed using flow cytophotometric method. To observe the time effect of burn serum, RAW264.7 cells were stimulated respectively with 2.5 ml burn serum alone or with 2.5 ml burn serum mixed with 100 mg/L LPS, for 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 24 hours and the content of the released TNF-α was determined using ELISA method. Result: 0.5 to 2.5 ml burn serum could markedly stimulate the secretion of TNF-α from RAW264.7 cell and the increase in secretion is significantly related to the dose of the serum. 2.5 ml burn serum could markedly induce RAW264.7 cell apoptosis. The secretion stimulated by burn serum alone and burn serum mixed with LPS had two peaks in 0 to 24 hours.Conclusion:Burn serum can markedly induce apoptosis and TNF-αsecretion of RAW264.7 cells.
     【Key words】 Burn serum; RAW264.7 cell, tumor necrosis factor; sepsis

  血清是机体在宏观水平上对组织细胞调控的重要介质，烧伤后血清成分的变化是烧伤在多种组织器官造成损伤的重要因素。烧伤血清是机体内稳态失衡的产物，与正常血清相比其在不同的组织细胞表现出复杂的生物效应而且表现出一定的时间依赖性［1，2］， TNF-α是由巨噬细胞和活化T细胞产生的一种细胞因子，具有多种重要的生物学活性，与脓毒症的发生有着十分密切的关系，是脓毒症发病过程中最主要的介质之一［3］。但烧伤血清诱导外周血单核巨噬细胞分泌促炎细胞因子TNF-α的规律和具体机制尚不明了，故我们采用烧伤血清来刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7，观察其TNF-α的分泌规律，并且对其凋亡情况进行研究。
     一、材料和方法
     1.材料
     （1）动物分组和血清制备：健康Sprague Dawley大鼠40只，雌雄各半（SPF级，由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供），体重量220g～320g，随机分为烧伤组（n=8）和正常对照组（n=4）。1％戊巴比妥钠（30mg/kg）腹腔注射麻醉，背部脱毛，20％Na2S脱毛并清洁皮肤，将脱毛区置于（92±1）℃水浴中12s，造成30％TBSAIII度烫伤（病理切片证实，本研究通称烧伤）。伤后立即按40ml/kg腹腔注入生理盐水抗休克，然后分别在伤后12、24 h取股动脉血4℃静置60min，待血凝块退缩，3000r/min，10min，取血清，分装，于-80℃低温保存。
     （2）主要试剂：LPS（E.coli.0111∶B4）与多黏菌素B（购自美国Sigma公司）；新生牛血清（FCS）（超级）（杭州四季青生物工程材料研究所产品）；琼脂糖；RPMI1640（购自生命技术公司Life Technology）；鼠TNF-双抗体夹心ELISA检测试剂盒（上海森雄科技实业有限公司提供，进口分装）。
     2.方法
     小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7在含10ml/L新生小牛血清的RPMI 1640培养基中培养传代4次至对数生长期，调整细胞数为5×109/L，培养于24孔细胞培养板中，置37℃50ml/L CO2孵箱培养4h后做下面的实验：
     （1）烧伤血清的剂量效应组分别用含有0.5，1.0，1.5，2.0，2.5ml烧伤血清的培养基与小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7共培养6h，分别收取烧伤血清刺激孔及对照孔细胞培养上清，5000r/min离心后留取上清备用。
     （2）烧伤血清的时间效应组以含有2.5ml烧伤血清的培养基、对照组以不含烧伤血清的培养基、另外以含有2.5ml烧伤血清和100mg/L LPS的混合组的培养基分别培养RAW264.7细胞0，2，4，6，8，10，12，24h，同上留取离心后的培养液上清。为防止LPS的干扰，提前在培养基中加入了10mg/L的多黏菌素B。以上每组均设4个复孔。用双抗体夹心ELISA法测定RAW264.7培养上清中TNF-α含量，具体操作按上海森雄科技实业有限公司试剂盒说明书进行。分别收集烧伤血清的剂量效应组中浓度为0.5、2.5ml孔的细胞，分成二部分。一部分用pH7.4的PBS洗2次，用200μl 1×结合缓冲液悬浮，加入annexin-V-FITC，室温闭光放置30min，再加入5μlPI，混匀后加入400μl PH7.4的PBS，利用流式细胞仪488nm波长分析细胞凋亡数量和程度。另一部分细胞加入200μlDNA裂解液，混匀，55℃水浴1h～3h，95℃灭活5min，再加入酚-氯仿-异戊醇体积比（25∶24∶1）抽提2次，直至无白色中间层。将上清液移入一新离心管中，加2.5倍体积冰冷的无水乙醇-20℃过夜，取出后12000g离心15min，小心吸弃上清，沉淀加入750ml/L冰冷乙醇12000g离心洗涤，室温干燥，用50μl双蒸水溶解DNA。取10μl做20g.L-1琼脂糖凝胶电泳，紫外灯上观察结果并摄片。
     3.统计学处理
     所有实验数据均以均数及标准差（x±s）表示，采用统计处理软件SPLM进行相关性分析。P＜0.05为差异具有显著性意义。  
     二、结果
     1.烧伤血清诱导RAW264.7细胞产生TNF-：正常培养的小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞TNF-分泌量极低，而经烧伤血清刺激后RAW264.7细胞能分泌大量的TNF-，烧伤血清诱导RAW264.7的TNF-分泌量与烧伤血清浓度呈显著的剂量依赖性关系（r=0.987，P＜0.05）（见图1）。
    
    

烧伤血清ml
图1 不同剂量血清对RAW264.7细胞分泌TNF-的诱导作用
Fig l The role of TNF-asecretion HMGB1-induced respones of burn serum

     2.RAW264.7分泌TNF-α的时间效应规律：三组培养基分别培养RAW264.7细胞，分别于0，2，4，6，8，10，12，24h，离心收集培养基上清。经ELISA法测定，烧伤血清组在培养6h后RAW264.7分泌TNF-α量达到第1次峰值，而在培养12h后其TNF-α分泌量达到第2次峰值，呈双相性规律。烧伤血清和LPS混合组大致也是如此，但是第l次达到峰值的时间提前至2h，且峰值更高。无烧伤血清对照组RAW264.7细胞TNF-分泌量极低（见图2）。
    
    

图2 各组不同培养时间的RAW246.7细胞TNF-分泌
Fig 2 The release of TNF-a from RAW264.7 cells after induced by the burn serum（BS） alone and mixed group（LPS+BS）
     3.烧伤血清诱导RAW264.7的凋亡：烧伤血清作用的RAW264.7经annexin-V-FITC和PI双染后，流式细胞仪分析显示，0.5ml烧伤血清组细胞的凋亡率为10.8％，2.5ml烧伤血清组RAW264.7细胞的凋亡率为21.6％（见图3），可见2.5ml烧伤血清组诱导RAW264.7细胞的凋亡率比0.5ml烧伤血清组为高。经20mg/L琼脂糖凝胶电泳分析，2.5ml烧伤血清组RAW264.7细胞DNA电泳可见典型的梯状条带，而0.5ml烧伤血清组细胞DNA电泳梯状条带不明显（见图3）。
    
    

M：DNA marker； 1∶0.5mL BS 2∶2.5mL BS
图3 RAW264.7细胞凋亡DNA电泳
Fig 3 Electrophoresis of DNA in RAW267 cells by burn serum（BS）

     三、讨论
     烧伤是以免疫、应激为核心的全身性的复杂病理生理过程，其突出特征是局部的损伤导致整个内稳态的失衡，进而影响到全身多个系统。烧伤血清是机体内稳态失衡的产物，与正常血清相比其在不同的组织细胞表现出复杂的生物效应而且表现出一定的时间依赖性［1，2］，然而由于技术手段的限制对于产生效应的物质基础始终没有得到很好的解释。
     烧伤血清如何介导LPS的致死效应，国内尚无报道。据张宇等［4］报道，100mg/L的LPS能很好地诱导小鼠普弗细胞（KC）ERK1/2活化和TNF-分泌，故我们采用100mg/L的LPS条件下对烧伤血清诱生TNF-的规律进行了探讨，证实烧伤血清刺激小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7可使其分泌大量的细胞因子TNF-，且TNF-的释放与烧伤血清刺激浓度间有显著的剂量依赖性关系，并且烧伤血清诱导TNF-的动力学特点与LPS明显不同：既往的研究表明LPS刺激单核细胞后TNF-的分泌呈一过性增高，而本实验表明烧伤血清诱生的TNF-的分泌则呈双相性规律，第l峰值出现得较早（2h），这可能是LPS的刺激而导致细胞TNF-分泌呈一过性增高引起的，这与国外的文献报道基本一致［5］。新近文献报道，除内毒素外， TNF-，N0等能诱导单核细胞合成晚期炎症介质HMGB1，而且IFNγ在HMGB1的分泌中也发挥着重要作用［6］，烧伤血清可以激活丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路和核因子кB诱导血管内皮细胞VCAM1的表达［7］，由此可见，在脓毒症中烧伤血清除了与早期介质TNF-的诱生密切相关外，其是否对晚期炎症介质HMGB1也有调控作用，从而使炎症“瀑布”效应不断放大、加重，进而导致脓毒性休克、MODS的发生值得进一步研究。
     我们研究证实，2.5ml的烧伤血清能明显诱导小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7细胞凋亡，并有典型的DNA梯状带出现。虽然具体的凋亡机制和意义尚有待进一步研究，但综上可见烧伤血清在脓毒症的发生和发展中起着重要作用是肯定的。对烧伤血清在脓毒症中作用进行研究不仅可以明确烧伤血清在脓毒症中确切发病机制，而且可以使我们对脓毒症的发生发展的认识提高到一个新的高度［8］。
    
    

参 考 文 献
    
［1］冉新泽，粟永萍，程天民，等.放射及复合烧伤大鼠腹腔灌洗液对骨髓造血祖细胞生长的影响［J］.中华放射医学与防护杂志，2003，23（3）：145-147.
［2］ZhangBo，Su Yongping，Wang Fengchaoet al. Identificaiton of differentially expressed proteins Of gamma-ray irradiated rat intestinal epithelial IEC-6 cells byTwo-dimensional gel electrophoresis and matric-assisted laserdesorption/ionisationtime Offlight mass spectrometry［J］.Proteomics，2005，5（2）：426-432.
［3］李春盛.关于脓毒症的几个问题.中国危重病急救医学，2002，14：323-328.
［4］Zhang Y，Jiang JX，Wang ZG，Wu PF，Ji SH，Shan YA，Zhou JH，A study on activation and role of ERK1/2 signal cascade in LPS-indeced response of mice kupffer cells［J］.Zhongguo Chuangxang Zazhi（Chin J Traumato1），2002，18（6）：364-366.
［5］Andersson U，Wang H，Palmblad K，Bloom 0，Janson A，Kokkola R，Yang H，Tracey KJ.HMGl stimulates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes［J］.J Exp med，2000；192（4）：565-570.
［6］Beatriz RM，Mahendar 0，Jianhua et a1.1FN-r Induces High Mobility Group Box l Protein Release Partly Through a TNF-a Dependent Mechanism［J］，J Immunol，2003：170：3890-3897.
［7］陈旭林，夏照帆，韦多，等.烧伤血清激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路和核因子κB诱导血管内皮细胞血管细胞黏附分子1的表达［J］.中华烧伤杂志.2005，21（6）：426-429.
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【作者简介】
 尹朝奇（1969～），男（汉族），河南南阳人，中南大学湘雅三院在读研究生，主治医师.
 罗成群（1949～），男（汉族），湖南衡阳人，衡阳医学院毕业，科主任，教授，博士生导师.
 贺全勇（1964～），男（汉族），湖南常德人，湖南医科大学毕业，烧伤整形专业博士，副教授，硕士生导师.

（收稿日期：2006-11-10）