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抗PEA受体结合区单克隆抗体的制备及鉴定

万忠海1，岳玉环2，杜付彬2，谭建华2，朱平2

【基金项目】国家自然科学基金资助项目（编号39770866）

【作者单位】1.吉林大学畜牧兽医学院，吉林长春130062

2.军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062

【摘要】目的：探讨绿脓杆菌外毒素A（PEA）中和性单克隆抗体在预防和治疗绿脓杆菌感染中的免疫保护作用。方法：以重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白免疫Balb/c小鼠，将免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法筛选细胞培养上清，采用有限稀释法对阳性孔进行克隆，3次克隆后获得4株能稳定分泌抗PEA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1C4，1D4，2E12和3C6。结果：细胞培养上清ELISA效价为4000~8000，腹水ELISA效价可达25600~51200，其中3C6抗体在细胞上的中和试验显示具有较高的中和效价，其亲和常数为8.93 × 108。结论：获得的单克隆抗体可在抗烧伤绿脓杆菌感染中发挥重要作用。

【关键词】绿脓杆菌外毒素A；ELISA；单克隆抗体

【中图分类号】R446.622；R392.116【文献标识码】A【文章编号】1001-0726（2007）04-0290-04

Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies Against PEA Receptor Binding Subuni Protein WAN Zhong-hai1, YUE Yu-huan2, DU Fu-bin2,  et al. 1.College of Animal Science and Veterinary Medicine,  Jilin University , Jilin, Changchun Province 130062, China; 2.Military Veterinary Institute, Academy of Military Medical Sciences, Jilin, Changchun Province 130062, China

【Abstract】 Objective：To study the immunoprotection of neutralizing monoclonal antibody against Pseduomonas-aeruginosa exotoxin A (PEA) so as to prevent and to treat the  infection of Pseduomonas-aeruginosa bacillus. Method：Balb/c mice were immunized with the recombinant protein of the receptor binding domain of pseudomonas exotoxin A(PEA). The splenic cells from the immunize mice were fused with SP2/0 myeloma cells. The cells were screened and the clear supernatant  was cultivated in ELISA. The positive hybridoma was cloned in limited dilution method so as to subclone the positive clones. After three cycles of subcloning, four McAbs against the PEA were obtained, designated as1C4, 1D4, 2E12 and 3C6. Results：The ELISA titers of culture supernatant and ascites were 4000-8000 and 25600-51200 respectively. The 3C6 McAb had higher neutralization titers, the affinity constant was 8.93×108M-1. Conclusion: The monoclonal antibody obtained in the study may bring the important effect on  resisting Pseduomonas-aeruginosa infection.

【Keywords】  PEA; ELISA; Monoclone Antibody

绿脓杆菌外毒素Ａ（PEA）是绿脓杆菌感染后主要致病因子之一，可导致大量细胞坏死和多器官功能衰竭，是大面积烧伤继发感染的主要致死原因之一。PEA是由受体结合区、越膜区、毒性区构成。它通过其受体结合区与组织细胞表面的受体结合后，由越膜区将其毒性区导入细胞而杀死靶细胞，导致组织坏死和器官功能衰竭，最终导致机体死亡。因此，阻断PEA与受体结合是预防和治疗绿脓杆菌感染的必要途径［1～3］，本实验将制备抗PEA的中和性单克隆抗体用于预防和治疗绿脓杆菌感染。

一、 材料与方法

1.材料：Balb/c小鼠购长春市生物制品所实验动物中心。SP2/0骨髓瘤细胞和Helo细胞由本室保存，新生小牛血清（超级）购自杭州四季青生物工程公司，RPMI1640、干粉培养基、PEA、弗氏佐剂、HAT盐和HT盐均购自sigma公司。

2.抗原制备：将表达质粒PET-28c-B10转入大肠杆菌  BL21（DE3）plys进行IPTG诱导表达后，将菌体裂解，用4M脲素洗涤包涵体，将包涵体溶解后进行Sephacryl-200分子筛层析，进一步DEAE-SepharoseFF离子交换层析，测定蛋白含量和纯度。将纯化的重组PEA受体结合区蛋白按1g/L与弗氏完全佐剂乳化，制成免疫原［4，5］。

3.动物免疫：选择雌性6周龄Balb/c小鼠5只，腹腔注射佐剂免疫抗原0.2ml。第14d时加强免疫一次（佐剂改用弗氏不完全佐剂，免疫剂量和部位同首次免疫），第25d时断尾采血，用ELISA方法检测抗体水平，在第45d时对免疫效果最好的Balb/c小鼠使用不加佐剂的抗原0.2ml加强免疫一次，3d后即可融合。

4.细胞融合：按常规方法进行。SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞以1∶10比例混和，在PEG作用下融合，用HAT培养基悬浮，均匀加入96孔细胞培养板中，置于37℃体积分数为5%的CO2培养箱中培养。

5.杂交瘤细胞的筛选与克隆：融合后，待细胞长到孔底的1/4时，用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行亚克隆，克隆3次后细胞生长孔100%为阳性。

6.杂交瘤细胞染色体计数：方法按参考文献［6］进行。

7.单克隆抗体亚类鉴定：用间接ELISA鉴定单抗亚类。

8.单抗生产和ELISA效价的测定：体外培养：将建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集培养液上清，测定ELISA效价。体内培养：取8周龄雌性Balb/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡0.3ml/只，7d后腹腔注射细胞1×106个/只，再7d后抽取腹水，离心取上清，测效价，冻存备用。

9.腹水IgG、IgM抗体的纯化［7］。

10.抗体分子量测定［8］：纯化后腹水，经变性SDS-PAGE电泳，对电泳结果进行薄层扫描分析，以Marker中标准蛋白在凝胶中迁移的相对迁移率为横坐标，以标准蛋白分子量的对数为纵坐标绘制标准曲线。根据抗体轻链和重链在凝胶中迁移的情况，计算抗体分子量。

11.腹水有效抗体浓度测定：腹水中除含有所需的特异性抗体外，还有大量的无关蛋白质，腹水中有效抗体浓度的测定采用夹心ELISA法［9］。

12.单抗亲和力测定：利用非竞争性酶免疫法测定抗体亲和力［10］。

13. 单抗中和效价测定：采用固定毒素稀释抗体法，将Helo细胞接种到96孔培养板中长满至单层，弃去生长液，用1640培养液清洗残余血清，加入维持液100μl，在另一块96孔板中将单抗（腹水）用维持液从1：100开始倍比稀释至1：25600，每个稀释度做2个重复孔，同时加入等体积的PEA50ng，37℃作用60min，然后每个稀释度取100μl加到有Helo细胞的培养板中，同时设正常细胞对照、毒素对照、小鼠阴性和阳性血清对照和SP2/0阴性腹水对照。置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中培养，3d~4d后观察细胞病变情况。

二、 结果

1.杂交瘤细胞筛选：融合后的细胞经ELISA试验2次筛选和3次克隆化，获得4株能稳定分泌抗PEA单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1C4，1D4，1E12，3C6。细胞连续培养3个月以上，生长良好且能保持稳定的分泌抗体能力。

2.杂交瘤细胞染色体计数及亚类鉴定：每株细胞计数5个染色体数目并算出平均值，可以看出，SP2/0的染色体的平均数为65条，脾细胞染色体为40条，而杂交瘤细胞的染色体数目在80条~97条之间。均高于两亲本细胞的染色体数目，说明这7株细胞的确是SP2/0细胞与脾细胞的杂交产物（见表1）。

表1单克隆抗体亚类及相应杂交瘤细胞染色体计数

Tab.1The subtype of monoclonal antibodies and the quantity of

 chromatosome of hybridoma

3.单抗ELISA效价：用ELISA试验对获得的4株单抗进行检测，小鼠腹水ELISA效价要比上清高6个滴度。细胞培养上清ELISA效价为4000~8000，腹水ELISA效价可达25600~51200。

4. 单抗腹水纯化：其中3C6的纯化结果如图1。

图1  3C6的纯化结果：1泳道为纯化前；2泳道为

Marker；3泳道为纯化后。

Fig.1 The results of ascites of 3C6： 1. ascites of 3C6;

2. Markerl; 3. purified ascites of 3C6

5.抗体分子量测定：对腹水3C6进行纯化和SDS-PAGE，利用Mark中的标准蛋白在凝胶中的相对迁移率与分子量的关系做标准曲线，横坐标为标准蛋白的相对迁移率，纵坐标为分子量的对数，用Excel进行曲线拟合并求回归方程。将3C6的重链和轻链在凝胶中的相对迁移率代入回归方程，分别计算出其分子量，再根据IgG中重链和轻链的比例关系，估算出3C6抗体分子量约为153.42KD。

6.腹水中有效抗体浓度测定（如图2）：根据公式测得有效浓度为：1.79mg/ml。

图2  单抗3C6腹水中有效抗体浓度测定

Fig.2  Determination of the antibody content

in purified ascites of 3C6.

7.单抗亲和力测定（如图3）：根据公式Ka=n-12×（n「Ab'」-「Ab」t）测得单抗3C6的亲和常数为8.93 X 108 M-1。公式中［Ab'］：表示抗原浓度为［Ag'］时OD=1/2ODmax对应的抗体浓度；［Ab］t：表示抗原浓度为［Ag］t时OD=1/2ODmax对应的抗体浓度；n：为抗原［Ag'］与［Ag］t间的稀释倍数。

图3  3C6抗体亲和力的测定

Fig. 3  Determination of the affinity of antibody in purified ascites o f3C6.

8.中和效价测定：4d后判定结果，毒素对照孔、鼠阴性血清孔和SP2/0阴性腹水孔细胞出现典型病变，鼠阳性血清和细胞对照孔正常，说明阴、阳性对照成立。3C6单抗的中和效价为：6400。

三、 讨论

　　绿脓杆菌外毒素A（PEA）是该菌的主要致病因子，具有致死作用和细胞毒作用。该毒素免疫动物得到的抗体不仅能够中和毒素的致死作用，而且对绿脓杆菌感染也有保护作用。但是PEA是一种很强的毒素，稍有不慎便可引起动物死亡，PEA行小鼠腹腔注射，其LD50为0.2μg/22g，行静脉注射，其LD50为0.06μg/22g［11］。因此必须进行适应性免疫，而且免疫失败的机会非常大。为了探索寻求更好的解决问题的办法和途径，在充分了解和研究PEA的结构和功能的前提下，亚克隆了PEA受体结合区亚单位基因并对其在大肠杆菌当中进行了表达与鉴定［12］，进一步探索了其对小鼠的免疫保护作用［13］。结果表明利用此抗原免疫既安全又有效。

　　本研究通过传统的杂交瘤技术获得了4株杂交瘤细胞，杂交瘤细胞是一种多倍体细胞，理论上其染色体应该为脾细胞染色体和SP2/0细胞染色体之和，大约应在102条~108条之间，可实际上观察到的杂交瘤细胞染色体数目在80条~97条之间。其原因就是杂交瘤细胞染色体不稳定，易丢失，但只要丢失的不是分泌抗体的染色体，就不会影响抗体的特异性和效价。所以阳性克隆细胞需及时检测，多次克隆化，才能获得较稳定的细胞株。由于考虑到后续工作的需要（制备单链抗体），只对亚型为IgG的3C6进行了详细的性质检测。

　　本研究将继续进行3C6抗体的动物实验并进一步制备抗PEA的单链抗体，来为烧伤后绿脓感染提供辅助治疗手段。

参考文献

［1］罗海波.细菌毒素研究进展［M］.北京：人民卫生出版社，1983.182.

［2］杨之骏.烧伤治疗［M］.上海：上海科技出版社1985.37.

［3］HwangJ，FitzgeraldDJ，Adhya，etal.Function adomains of Pseudomoase xotoxin identified by dilution analysis of the gene expressedin E.coli［J］.Cell，1987，48：129-136.

［4］刘晓明， 郭学军， 马从林，等.含绿脓杆菌外毒素A受体结合区重组蛋白的纯化［J］.中国兽医学报，1998，18（1）：38~41.

［5］王世若.兽医微生物学及免疫学［M］.长春：兽医大学，1983.223.

［6］章谷生，容秉培.单克隆抗体在医学上的应用［M］.上海：科学技术出版社，1987：2812406.

［7］曹军平，闫桂玲，刘秀梵，等.两种简易高效的单克隆抗体提纯方法［J］.单克隆抗体通讯，1995，11（2）：52-54.

［8］魏书林，曹振，沈建忠，等.抗氯霉素单克隆抗体的制备与鉴定［J］.中国兽医杂志，2004，40（2）：62-64.

［9］王谦.抗链霉素单克隆抗体制备与ELISA检测方法的建立［C］.中国优秀博硕士论文全文-中国农业大学论文 2003，5.

［10］董志伟，王琰.抗体工程［M］. 北京医科大学出版社（第二版），2002， 280-281.

［11］雷祚荣.细菌毒素分子生物学［M］. 北京：中国科学技术出版社， 1993. 132.

［12］万忠海，王景林，江禹，等.绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白基因重组与鉴定［J］.中国兽医学报， 2002（6）：571-573.

［13］万忠海，何畅，江禹，等.重组绿脓杆菌外毒素A受体结合区蛋白动物免疫保护试验［J］.中国兽医学报， 2001（4）：359-361.

【作者简介】

万忠海（1968~），男（汉族），吉林省长春人，毕业于解放军军医大学，现就读于吉林大学农学部畜牧兽医学院，从事分子细菌学专业，军事兽医研究所助理研究员.

岳玉环（1963~），女（满族），吉林省长春人，毕业于东北师范大学，从事分子生物学、基因工程药物专业，军事医学科学院军事兽医研究所副研究员.

谭建华（1956~），男（汉族），吉林省大安人，毕业于解放军农牧大学，从事动物生化专业，军事医学科学院军事兽医研究所副研究员.