陶克奇，李利平
【作者单位】南华大学附属第一医院烧伤整形外科，湖南衡阳421001
【摘要】表皮干细胞具有无限增殖和分化的潜能，对维持表皮的自我更新、保持皮肤的正常结构以及对皮肤的创伤修复具有重要意义。表皮干细胞的研究已引起越来越多研究者的关注。本文就目前表皮干细胞的生物学特征、表面标记、分布特征和在创伤修复中的变化等方面的研究进展作一综述。
【关键词】表皮干细胞；生物特征；表面标记；分布特征；分化调控
【中图分类号】R3292;R641
【文献标识码】A
【文章编号】1001-0726（2006）02-0088-05
Epidermal stem cell and wound repair
TAO Ke-qi, LI Li-ping
Dept. of Burns and Plastic Surgery, the 1st Affiliated Hospital, South China University, Hengyang, Hunan Province 421001,China
【Abstract】Objective: Epidermal stem cells have the potentiality of infinite multiplication. This is of great significance in the maintenance of epidermis self-renewal to keep normal structure of the skin and the repair of skin wound. The research on epidermal stem cell has attracted more and more interest of the researchers. This paper gives a review of the current status of the research on epidermal stem cell including biological features, surface marker, distribution features, and changes in wound repair, etc.
【Key words】Epidermal stem cell; biological features; surface marker; distribution features; differentiation regulation and control
干细胞是指一类具有终身、无限的自我更新能力的细胞，其能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。正因为干细胞具有多向分化的潜能、自我更新的能力，对组织器官的创伤修复具有重要意义，故干细胞的研究受到越来越多研究者的关注。根据不同的分化潜能，干细胞可分为：（一）全能干细胞（totipotent stem cell）,即受精卵，其具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，能形成完整的个体。（二）多能干细胞（pluripotent stem cell）,如表皮干细胞（ESC）、骨髓间充质干细胞（MSC）等，其具有产生多种类型细胞的能力，但不能发育成完整的个体。（三）专能干细胞（unipotent stem cell），即存在于特定组织中，其具有分化形成特定组织能力的细胞，如胰腺干细胞、肠上皮干细胞等。通常干细胞的分裂方式为等数分裂，即分裂为一个子代干细胞和一个定向祖细胞，其定向祖细胞最后形成终末分化细胞。当机体受到损伤时，干细胞的分裂方式会发生改变，如直接分裂为两个子代干细胞或者两个定向祖细胞，以适应机体的需要［1］。表皮干细胞作为皮肤这一人体最大器官的特异多能干细胞，对维持表皮的自我更新、保持皮肤的正常结构以及对皮肤的创伤修复具有重要意义。本文就表皮干细胞的生物学特征、表面标记、分布特征、分化调控等方面的研究进展综述如下。
一、表皮干细胞的生物学特征
表皮干细胞作为各种表皮细胞的祖细胞，其在形态学上具有未分化细胞的特点，表现为体积小，核大，核浆比例大，细胞内RNA含量低，大多数处于G0/G1期，分裂增殖活性相对静止［2 ,3］。
表皮干细胞通常处于静息状态，分裂缓慢，其典型的两个特点是：（1）自我更新增殖能力(self-renewal and multiplication)。通过对造血系统干细胞的多年研究证实，体内或体外的克隆分析是最好的检测细胞增殖能力的实验方法。单个细胞的形成克隆增殖潜能可分为：①完全克隆（holoclone）；②部分克隆（meroclone）；③终末克隆（paraclone），其增殖潜能逐渐下降。表皮干细胞在体外培养呈完全克隆性生长。Pellegrini等［4］体外培养人皮肤角质细胞的实验提示，如连续传代培养表皮干细胞，其可进行140次分裂，即能产生1 χ 1040个子代细胞，培养的表皮细胞足以维持个体一生中表皮更新所需的量。（2）慢循环性（slow cycling）。其主要表现为标记滞留细胞（Label-Retaining cell, LRC）。Bickenbach等［5］于1981年首次用氚标记的胸腺嘧啶核苷酸（3HTdR）证实了小鼠皮肤基底层细胞中有标记滞留细胞群体，且证实为表皮干细胞，小鼠表皮干细胞的标记滞留时间可长达2年之久。
二、表皮干细胞的表面标记
对表皮干细胞进行鉴定、分离和培养，关键是要找到表皮干细胞的表面特异性标记物。目前对表皮干细胞的表面特异性标记物尚无统一结论，但一些细胞表面糖蛋白，如整合素家族的integrinβ1、integrinα6，角蛋白K19，基因物质P63等被作为表皮干细胞的特异性标记物已受到众多研究者的关注［6］。
1.整合素（Integrin）
整合素为一类位于细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子，该类分子在正常情况下主要介导细胞与细胞外基质的黏附，使细胞内骨架与细胞外基质得以整合而成为整体；同时也参与细胞与细胞间的黏附；在许多病理生理过程（如细胞分裂、分化、凋亡、炎症、组织修复等）中也起着重要的作用。整合素家族一般分为VLA亚家族（β1亚家族）、白细胞整合素亚家族（β2亚家族）、细胞黏附素亚家族（β3亚家族）等。在创伤研究中，用荧光标记的integrin β1单抗与表皮基底层角质形成细胞共同孵育后经流式细胞仪分选，得到两种类型的细胞，即integrin β1高表达细胞和integrin β1低表达细胞。经培养证实integrin β1高表达细胞具有更高的克隆形成能力，传代次数显著多于integrin β1低表达细胞，将其移植于皮肤缺损创面后能够生成完整的上皮层，证实表皮基底层的integrin β1高表达细胞群富含角质干细胞（KSC）［7］。但也有实验表明表皮干细胞的子代细胞——短暂扩充细胞（transit amplifying cell，TAC）也表达较高的integrin β1［8］。因此，寻找区别表皮干细胞和短暂扩充细胞的特异性标记物已引起越来越多研究者的关注。
也有学者把细胞表面的integrin α6与另一个与增殖有关的表面标记10G7结合起来区别表皮干细胞和短暂扩充细胞，实验结果发现integrin α6阳性而10G7阴性(integrin α6bri10G7dim)的细胞处于静息状态，在体外培养中具有很强的增殖潜能，证实为表皮干细胞；而integrin α6与10G7均阳性(integrin α6bri10G7bri)的细胞为短暂扩充细胞，在体外培养证实其增殖能力有限；integrin α6阴性的细胞角蛋白10(keratin 10, K10)则呈阳性表达，表明为有丝分裂后终末分化细胞。因此可以把integrin α6和10G7结合起来区分表皮干细胞、短暂扩充细胞和已分化的表皮细胞［9］。
2.角蛋白K19（keratin 19）与角蛋白Ｋ15 (keratin 15)
角蛋白是皮肤上皮细胞的结构蛋白，它们构成微丝在细胞内形成广泛的网状结构。表皮细胞随其分化程度的不同而表达不同的角蛋白。Michel等［10］研究了表皮细胞中角蛋白K19的表达，角蛋白K19表达细胞在表皮中所占数量较少，且大部分位于毛囊外根鞘隆突部，用氚标记的胸腺嘧啶核苷酸（3HTdR）标记角蛋白K19细胞证明其为慢循环细胞，这些特征均符合传统对表皮干细胞的认识。因此，认为角蛋白K19是表皮干细胞的一个表面标记物。徐荣祥等发现在烧伤创面的修复过程中出现的干细胞主要是K19型，表明K19型阳性的干细胞可能是皮肤原位再生的种子细胞［11］。此外，又有实验发现毛囊隆突部表皮干细胞表达角蛋白K15（keratin 15，K15），而且在干细胞的分化过程中，K15表达的减少较K19表达的减少更早，K15阴性而K19阳性的细胞可能是“早期”短暂扩充细胞，故K15可能较K19在鉴别毛囊隆突部表皮干细胞更有意义［12］。
3.表皮干细胞的其它表面标记
有研究显示P63转录因子（与P53同源）可用于鉴定表皮干细胞。体外培养角质形成细胞并进行克隆分析，可将其培养的细胞分为全克隆细胞和部分克隆细胞，P63在全克隆细胞中大量表达，而在部分克隆细胞中几乎不表达［13］。此外，对cateninγ的研究表明其在表皮干细胞中高表达，在短暂扩充细胞中低表达，但其特异性尚需进一步论证［14］。
三、表皮干细胞的分布特征
表皮干细胞作为一种组织特异性干细胞，对维持皮肤组织的正常生长、自我更新及皮肤创伤后愈合具有重要的意义，然而表皮干细胞在组织中的分布与其在组织中的作用有密切的关系，故表皮干细胞在组织中的分布具有特异性。
1.在正常皮肤中的分布
在正常皮肤中，一般认为表皮干细胞位于毛囊隆突部［2,15,16,17,18,19］（即皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊外根鞘），且与短暂扩充细胞（TAC）在表皮基底层呈片状分布。Moll I等［19］将生长期人毛囊横切成四部分进行分段体外培养，发现绝大部分克隆形成细胞来自于含有隆突部的片段，仅少数克隆形成细胞来自毛球部。此说明表皮干细胞主要位于毛囊隆突外根鞘部。在没有毛囊的部位，如手掌、脚掌等处，表皮干细胞位于与真皮乳头顶部相连的基底部［21］。许多研究结果表明表皮干细胞在不同皮肤组织中的含量有很大的差异。Michel等［10］用角蛋白K19作为表皮干细胞的表面标记研究发现，体内表皮干细胞的含量随着年龄的增长而逐渐减少。赵志力等［22］研究了不同发育阶段的人皮肤表皮干细胞的含量差异，结果提示胎儿期表皮基底层增殖细胞均为表皮干细胞和短暂扩充细胞，而少儿期表皮基底层中部分细胞为表皮干细胞和短暂扩充细胞，成年人期表皮干细胞和短暂扩充细胞的比例则进一步降低。这种表皮干细胞增殖分化的差异可能与三种不同发育阶段皮肤损伤的完全与不完全修复有关。
2.在创面修复和瘢痕等异常组织中的分布变化
在异常的组织结构中，表皮干细胞的分布差异较大。孙晓庆等［23］用β1整合素与角蛋白K19作为表皮干细胞的表面标记物研究了正常皮肤与陈旧性瘢痕（愈后1年）的增殖潜能差异，结果显示瘢痕组织表皮基底层中具有增殖能力的表皮干细胞和短暂扩充细胞数明显少于健康正常皮肤。而罗成群等［24］用角蛋白K19作为表面标记物研究正常皮肤与新生瘢痕（愈后2个月以内）组织中增殖细胞分布，结果提示新生瘢痕中的表皮基底层有角蛋白K19表达阳性的细胞，而且在再生表皮的中部，即位于基底细胞与角质细胞层之间有大量的角蛋白Ｋ19表达阳性的细胞，且分布广泛，而正常皮肤只有表皮基底层和附件有角蛋白K19表达阳性细胞。
谢举临，利天增等［25］研究了不同深度烧伤创面组织中表皮干细胞的分布，结果表明表皮干细胞在烧伤创面中的分布与烧伤深度有关，在Ⅰ度烧伤创面组织中表皮干细胞分布于表皮基底层，数量较多；浅Ⅱ度烧伤创面组织中表皮干细胞位于残留的基底层和皮肤附属器（主要是毛囊）中，数量较少；深Ⅱ度烧伤创面组织中，表皮干细胞仅存在于真皮深层健存的皮肤附属器中，数量很少；而Ⅲ度烧伤创面中表皮干细胞罕见，残存的表皮干细胞可能是创伤修复过程中再上皮化细胞的来源。李建福等［26］用β1整合素与角蛋白K19作为表面标记物研究创面愈合过程中创缘表皮干细胞的再分布，结果显示在创缘表皮的棘层或颗粒层出现了散在的β1整合素与角蛋白K19同时染色阳性的细胞，且越接近创面这些阳性细胞更加密集，组织学上与基底层的阳性细胞无直接联系；其数量随着创面的缩小而消失；感染创面的阳性细胞数量明显少于未感染创面。
以上都是在没有进行适当处理的创面上或仅在伤后立即获取的标本中得到的结果，由于创面条件根本无法满足干细胞增殖分化的需要，因此上述结果只是反映创面未发生代偿性增殖反应时的情况，并不能反映深度创面修复过程中的干细胞动态变化规律。徐荣祥等［11］的研究却发现在深度烧伤创面中表皮干细胞的出现和激活与创面的处理和创面的局部环境有很密切的关系，他们通过采用一种可以无损伤液化并排除坏死组织，提供湿润生长环境和培养基的药物－MEBO处理浅III度创面，用药后24小时在创面下皮下组织的脂肪隔纤维组织中出现了K19型干细胞，4天时开始大量出现，7天时达到高峰，21天时开始下降，此时创面已经愈合，出现大量皮岛。说明表皮干细胞在异常组织或创面中的演变规律是很复杂的，与病因、处理方法、局部环境和生长条件、使用药物等等都有密切的关系，人体疾病的发生和发展是一个动态的变化过程，干细胞的变化也是一个动态的过程，因此要求研究者不能片面地用静止的眼光去研究它，应该使用多因素分析而不是单因素的研究手段，通过动态追踪，才能探询其规律，否则得到的结果也是片面的。
四、表皮干细胞的分化调控
干细胞的分化受其所处的微环境［又称干细胞壁龛（niche）］的影响是毋庸质疑的。起源于外胚层的表皮干细胞的分化调控也不例外。表皮干细胞壁龛由邻近的各种细胞、细胞分泌的各种细胞因子、细胞膜蛋白介导的细胞间作用以及整合素和细胞外基质等构成。由各种细胞分泌的细胞因子通过介导表皮干细胞与邻近细胞（包括间质细胞如成纤维细胞、肥大细胞等）、表皮干细胞与细胞外基质的相互作用，从而调控表皮干细胞的分化增殖。这些细胞因子包括β—转化生长因子（TGFs）、白细胞介素（ILs）、干细胞生长因子（SCF）、成纤维细胞因子（FGF）、表皮细胞生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）等。其中β—转化生长因子家族和Wnt家族通过调控表皮干细胞的对称分裂和不对称分裂，对维护表皮干细胞的自我更新起着重要作用。β-链蛋白（β—catenin）是连接钙黏蛋白和肌动蛋白的一种细胞骨架蛋白，在表皮干细胞处于静息状态时呈低水平表达，当ESCs进入分化状态时，胞内β—链蛋白在核内积聚，浓度上调，高度激活β—链蛋白可导致ESCs向毛发分化，而缺少或低强度激活β—链蛋白，则促进其分化成皮脂腺或角质细胞（keratinocyte，KC）［27，28］。此外，细胞外基质成分改变也影响表皮干细胞的分化，其主要通过阻碍和/或调控表皮干细胞微环境中细胞因子的浓度来实现。有实验表明，感觉神经肽P物质（SP）在创面愈合过程中有促进ESCs定向迁移的作用［29］。
五、展望
表皮干细胞的研究虽然取得了初步的成果，对其应用具有广泛的前景，但目前仍有许多问题亟待解决，如在异常组织结构中表皮干细胞的演变规律？表皮干细胞的分化调控与每一种细胞外基质成分的关系怎样等？如何从整体的角度出发，在异常组织或发生缺损的组织器官原位启动表皮干细胞的正调控机制，建立表皮干细胞生长的微环境是干细胞应用科学中的难点和必由之路。
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【作者简介】
陶克奇（1978~ ），男（汉族），湖南武岗人，武汉科技大学医学院毕业，现就读于南华大学附一医院烧伤整形外科学硕士。主要从事表皮干细胞生物学特征及应用方面的研究，住院医师.
李利平（1959~），男（汉族），湖南安仁县人，湖南湘雅医学院毕业，外科学教授，主任医师.
（收稿日期：2005-08-28；修回日期：2005-10-12）
