张晶，王强，孙风梅，张磊，任莉
滨州医学院附属医院眼科，山东滨州256603
【摘要】目的：探讨羊膜移植联合湿润烧伤膏对急性期角膜碱烧伤的影响。方法：采用兔角膜碱烧伤模型，比较湿润烧伤膏以及羊膜覆盖法联合应用与两者单用的治疗效果。结果：两者联合应用可进一步促进角膜上皮修复，减少胶原纤维的断裂溶解，结膜充血情况明显改善。结论：湿润烧伤膏联合羊膜覆盖治疗急性兔角膜碱烧伤的效果优于两者单用。
【关键词】羊膜移植；湿润烧伤膏；急性角膜碱烧伤；联合治疗
【中图分类号】R643；R7722【文献标识码】A【文章编号】1001-0726(2005)04-0253-04An experimental study of the efficacy of amnion transplantation in combination with of local application of MEBO in treating acute alkaline burn of cornea in rabbit Zhang Jing, Wang Qiang, Sun Feng-mei, et al., Dept. of Ophthalmology, Affiliated Hospital of Binzhou Medical College, Binzhou, Shandong Province 256603,China
【Abstract】Objective: To investigate the efficacy of amnion transplantation in combination with local application of MEBO in treating acute alkaline burn of rabbit cornea. Method: In the rabbit model of acute alkaline burn of cornea, the therapeutic effect of amnion transplantation in combination with local application of MEBO was compared with that of amnion transplantation or MEBO alone. Result: Amnion transplantation in combination with MEBO can further promote repair of corneal epithelium, reduce fragmentation and dissolution of collagen fibers, and improve conjunctival congestion. Conclusion: The curative effect of MEBO in combination with amnion transplantation in combination with MEBO was superior to amnion transplantation or MEBO alone. So this method is worthy to be further researched.
【Key words】Amnion transplantation; MEBO; acute alkaline burn of cornea; combined treatment
眼化学性烧伤是常见眼外伤之一，常因引起角膜浑浊、角膜新生血管长入、假性胬肉长入及睑球粘连而致盲。传统的治疗方法效果差。近年来，羊膜重建眼表日益受到重视，而湿润烧伤膏作为一种止痛效果明显，又能增加局部营养药物，对角膜碱烧伤的治疗是否起积极作用？基于此种考虑，我们联合这两种方法，对兔急性期角膜碱烧伤进行了实验研究。
一、临床资料
1.材料
(1)动物：健康新西兰大白兔40只，体重2.0～2.5Kg（雌雄不限）。经眼科检查双眼无任何眼病，随机分成4组，每组10只。1组烧伤后作为对照，2组眼表涂湿润烧伤膏，3组眼表覆盖羊膜，4组眼表覆盖羊膜+涂湿润烧伤膏。
(2)羊膜制备与保存：产前血清学检查证实HIV(-),HBV(-),HCV(-)以及USR(-)的孕妇，剖宫产时取其胎盘，在无菌条件下，用林格氏液冲洗干净胎盘表面血迹，用含抗菌素的生理盐水（含青霉素100μɡ/ml，链霉素50μɡ/ml，二性霉素2.5μɡ/ml）浸泡胎盘5min-10min，钝性分离羊膜与绒毛膜，上皮面朝上平铺于硝酸纤维纸上，剪成4cm×3cm方形小块，放入无菌(DMEM:甘油=1∶1)保存液小瓶中，置-80℃冰箱内保存。
(3)湿润烧伤膏：“美宝”牌湿润烧伤膏，由北京美宝烧伤创疡研究所、汕头市美宝制药有限公司制作。国药准字Z 20000004。简称:MEBO。
2.方法
(1)兔角膜碱烧伤模型：用5%戊巴比妥钠溶液按1ml/kɡ剂量行兔耳缘静脉麻醉，以1%丁卡因滴眼表面麻醉，开睑器开睑，充分暴露眼前段，将浸有1mol/NaOH溶液直径8mm的圆形滤纸放于角膜中央约30秒，生理盐水快速冲洗结膜囊及眼表，建立角膜碱烧伤模型。
(2)手术方法：沿角膜缘全周剪开球结膜，剥离角膜表面坏死组织及角膜上皮（保留角膜缘处），将备好的羊膜室温下用加入庆大霉素8万单位的无菌生理盐水500毫升浸泡30min，剪成直径18mm的圆形羊膜片，上皮面朝上铺于眼表面，其边缘超出角膜缘2mm，用10-0尼龙缝线连续或间断缝合固定于浅层巩膜，使羊膜紧贴角膜创面，然后将球结膜缝回角膜缘。
(3)术后处理：1组不做处理，2组每4小时涂湿润烧伤膏1次，3组眼角膜表面覆盖羊膜（方法见上），4组眼角膜表面覆盖羊膜+每4小时涂湿润烧伤膏1次。
(4)组织切片：于术后第15天采用气体栓塞法处死实验兔。摘除眼球，剪下完整角膜，标本经10%甲醛固定、95%乙醇脱水后，石蜡包埋，切片50μm厚，行HE染色，显微镜下观察。
二、结果
术后羊膜植片4～5天内呈灰白轻度水肿，随后逐渐透明，厚度正常。羊膜移植眼，第4天3组羊膜脱落6眼，4组羊膜脱落4眼。第7天3组羊膜脱落2眼，4组羊膜脱落3眼。
大体观察及裂隙灯检查结果见表1。
表1治疗后眼部大体观察以及裂隙灯检查结果组别〖〗眼睑自由闭合〖〗结膜充血〖〗角膜表面粗糙〖〗出现新生血管〖〗角膜瘢痕〖〗新生血管进入角膜内沿1〖〗无〖〗++++〖〗++++〖〗第5天〖〗++++〖〗4mm2〖〗无〖〗+++〖〗++++〖〗第4天〖〗++〖〗4mm3〖〗有〖〗++〖〗+〖〗第7天〖〗++〖〗2mm4〖〗有〖〗+〖〗+〖〗第7天〖〗+〖〗2mm显微镜下观察结果见表2。表2治疗后显微镜下观察结果组别〖〗角膜上皮〖〗胶原纤维断裂溶解〖〗新生血管面积〖〗基质层多心和白细胞浸润1〖〗愈复差，脱失〖〗++++〖〗++++〖〗++++2〖〗愈复一般〖〗+++〖〗+++〖〗++3〖〗愈复良〖〗++〖〗+〖〗++4〖〗愈复好〖〗+〖〗+〖〗+图11组：对照组(HE×66)上皮脱失，固有层上部少量炎性细胞浸润。
图22组：眼表涂湿润烧伤膏组（HE×33）边缘上皮增生，中央见炎性细胞浸润、出血，固有层有少量炎性细胞浸润。
图33组：眼表覆盖羊膜组（HE×33）表面上皮增生，从边缘向中央延伸，中部见炎性细胞浸润，无血管增生，无充血、水肿。
图44组：眼表覆盖羊膜+涂湿润烧伤膏组（HE×66）上皮愈合良好，上皮下血管扩张，少量炎性细胞。
三、讨论
1.角膜碱性烧伤的治疗，传统的治疗方法是对症处理。如：A.在紧急处理中应用弱酸性中和液冲洗，中和剂结膜下注射等，B.在综合治疗中，（1）早期应用广谱抗生素、糖皮质激素药物，（2）改善组织营养，促进烧伤愈合：自血疗法，多种维生素的应用，如VitA，VitB2可以促进角膜上皮的再生，大量VitC对碱性化学伤可改善角膜结膜的营养状态，（3）扩张血管的药物的应用，如口服地巴唑、烟酸等药物；改善局部血液循环、促进组织的修复，（4） EDTA，半胱氨酸、乙酰半胱氨酸滴眼液等胶原酶抑制剂可阻止角膜组织溶解，防止发生角膜溃疡。（5）散瞳剂的应用等。但传统的药物治疗其效果往往不理想，尤其是中重度碱烧伤，由于结膜严重缺血、坏死和角膜缘血栓形成，恶化了角膜周围的环境，使角膜缺氧，营养严重障碍，受损的角膜上皮不能再生，溃疡经久不愈，不可避免的结膜瘢痕化、角膜血管化及严重的睑球粘连［1］。对于碱烧伤后遗留的影响视力的角膜混浊，行角膜移植是目前的最佳选择。但由于现在供体角膜缺乏，术后容易发生排斥反应及其他并发症，以及费用昂贵等，限制了其在碱烧伤方面的应用。所以，如何在治疗期间更好的维持、保护角膜的透明性，减少并发症的发生，减轻炎症反应和临床症状，是目前在研究碱烧伤领域中的一个热点。眼表是近20年提出的新概念，它是指由角膜上皮、结膜上皮和泪膜共同组成的屏障结构。正常的眼表结构是维持角膜的透明性、角膜表面光学镜作用、眼球和眼睑活动所必需的［2］。 某些原因，如碱烧伤，破坏了眼表结构或使其功能不全，将导致一系列病理生理变化，出现角、结膜表面干燥、角膜损害、眼球运动障碍等。近十年来，随着角膜缘干细胞、结膜干细胞、眼表面泪膜的生理和病理及细胞生物学特性等方面的深入研究，同时对以往眼表面的基础研究及其整体概念进行了更新，致使原来认为诸多不能治疗的患者重新获得治疗机会。目前，眼表重建术常见有四种术式［5］：(1)结膜移植术，(2)结膜角膜缘上皮移植术，(3)角膜上皮移植术，(4)羊膜移植术。羊膜移植主要是使用保存人羊膜作为基底膜重建眼表结构。对于角膜基质变薄、溃疡形成及穿孔的患者，行多层羊膜移植，其目的是利用羊膜的基底膜作用，部分代替病变角膜、重建眼表，为以后二期角膜移植争取机会［3］。
2.羊膜是胎盘的内层，是由滋养细胞层分化而来，是薄而半透明状，是人体最厚的一层基底膜。正常羊膜无血管，厚度为0.02mm～0.5mm，组织学可分为五层：从内向外依次为上皮细胞层、基底膜、实质层、纤维细胞层和海绵层。在临床应用前，处理羊膜的过程中，纤维细胞层和海绵层常被剥离，所以，临床上常用的羊膜组织通常缺少这两层组织。又由于在处理和保存过程中，上皮细胞层脱失和死亡，保存羊膜只含有基底膜和致密层。羊膜的治疗目的与下述特性有关：(1)基底膜作用：羊膜可产生多种生长因子，如成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、转化生长因子等，有利于上皮细胞分化移行，增强上皮细胞黏附性，调节结膜上皮转化为角膜型上皮细胞［7、8］，并可作为支架组织部分代替角膜基质。(2)抗炎、抗纤维化、抗新生血管作用：眼部外伤后，由于局部炎症反应，大量炎细胞侵入，释放大量白细胞介素-1及前列腺素，诱发角膜新生血管的形成。而羊膜中含有抑制细胞因子表达和调节角膜细胞凋亡的成分，可以避免炎细胞和细胞因子诱发的角膜基质细胞、胶原纤维的过度增生以及新生血管的形成从而抑制局部炎症反应、阻止新生血管及瘢痕的形成［9、10］。(3)无抗原性：经甘油保存的羊膜，无抗原性，移植后不会发生排斥反应。
3.湿润烧伤膏（MEBO）采用对人体无害的食用油剂精制而成，其主要成分有黄柏内酯、β-谷甾醇、麻油、蜂蜡等。本次动物实验研究观察表明，MEBO治疗组与对照组相比，有明显减轻局部症状的作用。根据MEBO 的药理特性，认为取得显著疗效的机制可能与以下因素有关［11］：(1)中和作用。MEBO保持创面湿润、引流通畅，对酸、碱均有中和作用。通过引流作用，及时将反应产物排除创面，同时还能与部分毒性化学物质发生水解、酶解及络合反应，发挥解毒、排毒作用。(2)改善微循环，促进创面愈合。MEBO保持创面湿润防止水分及微量元素丢失，为上皮细胞增殖提供了一个近似于生理的环境条件。湿润和药物成分的作用阻止了创面组织的恶性发展，最大限度地保留了有活力的组织。生理湿润环境也保证了药物活血化瘀和祛腐生肌作用的发挥，同时可促进微循环功能早期恢复和淤滞带组织复生，从而避免了创面组织进行性坏死。(3)防止角膜斑翳形成。MEBO为大分子粘性基质组成，与创面蛋白有亲和力，起桥梁作用，促进创面愈合。MEBO中含有创面恢复所需的葡萄糖，可补充其能量不足，维生素及有机酸可直接参与营养支持，避免瘢痕组织形成。(4)对角膜缘干细胞的保护作用。角膜缘干细胞在化学烧伤中极易受损，徐荣祥、许增禄的研究已经证实，MEBO可使烧伤残余组织中的普通组织细胞，转变为角蛋白19型皮肤干细胞，同时又能保障和促使角蛋白19型干细胞增殖、分化为皮肤全部器官。所以这一原位再生皮肤器官的作用，在眼角膜损伤的修复治疗中得以再现。
4.通过对本课题实验结果的分析，我们可以发现第4组实验兔的综合症状、体征（如眼睑能否自由闭合、结膜充血、分泌物的多少、角膜表面粗糙程度、出现新生血管的时间、深度、及角膜瘢痕的形成）的改善均优于第1、2、3组。通过显微镜下观察，对比角膜上皮的修复、新生血管的多少及基质层多核性白细胞的多少和浸润深度等亦可证实第4组各项指标均优于第1、2、3组。所以，羊膜移植联合湿润烧伤膏治疗急性期角膜碱烧伤可以起到协同作用。通过羊膜移植重建眼表建立起治疗的基本框架，恢复眼表正常解剖结构及功能，更加符合眼的生理，减轻症状。在本实验对照组中，羊膜移植组的实验兔眼睑均能自由闭合，角膜表面较光滑，分泌物少。MEBO一方面可以提供碱烧伤修复时所需要的营养物质，另一方面可以从分子、细胞生物学层次上给予碱烧伤修复以支持，具有明显防感染功能和促进创面加速愈合的作用。通过此次实验研究，羊膜移植联合湿润烧伤膏治疗急性期角膜碱烧伤的效果较满意，且操作简单可行，但长期效果及作用机制还需要进一步研究并行临床实验进行证实。
参 考 文 献
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【作者简介】
张晶(1954～)，女(汉族)，滨州市人，1977年山东医科大学毕业，现从事眼科专业，教授，主任医师.
王强(1965～)，男(汉族)，山东阿胶县人，1987年滨州医学院毕业，眼科教授.
孙风梅(1962～)，女(汉族)，山东阿胶县人，1984年济宁医学院毕业，图书馆副研究馆员.（收稿日期：2005-08-20；修回日期：2005-09-28）
